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Dec 01, 2023

Une boîte à outils optogénétique pour la lumière

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1034 (2023) Citer cet article

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Les antibiotiques sont un mécanisme de contrôle clé pour la biologie synthétique et la microbiologie. Les gènes de résistance sont utilisés pour sélectionner les cellules souhaitées et réguler les populations bactériennes, mais leur utilisation à ce jour est restée largement statique. Un contrôle spatio-temporel précis de la résistance aux antibiotiques pourrait permettre une grande variété d'applications nécessitant un contrôle dynamique de la sensibilité et de la survie. Ici, nous utilisons la recombinase Cre inductible par la lumière pour activer l'expression des gènes de résistance aux médicaments chez Escherichia coli. Nous démontrons une résistance activée par la lumière à quatre antibiotiques : la carbénicilline, la kanamycine, le chloramphénicol et la tétracycline. Les cellules exposées à la lumière bleue survivent en présence de concentrations mortelles d'antibiotiques, contrairement à celles maintenues dans l'obscurité. Pour optimiser l'induction de la résistance, nous varions le promoteur, le site de liaison du ribosome et la force de la variante enzymatique à l'aide de constructions à base de chromosomes et de plasmides. Nous lions ensuite la résistance inductible à l'expression d'une enzyme d'acide gras hétérologue pour augmenter la production d'acide octanoïque. Ces outils de résistance optogénétique ouvrent la voie au contrôle spatio-temporel de la survie cellulaire.

Les gènes de résistance aux antibiotiques sont largement utilisés en biologie synthétique. Ils sont inclus dans des constructions génétiques pour assurer la propagation plasmidique. Les gènes de résistance jouent également un rôle important dans les méthodes de clonage. Les exemples incluent les insertions chromosomiques, où l'expression des gènes de résistance peut être utilisée comme marqueur sélectif pour une intégration réussie1, ou dans la création de bibliothèques de transposons, où la résistance aux médicaments est utilisée comme mécanisme de sélection intermédiaire avant d'être échangée contre une séquence alternative2,3.

Bien que les gènes de résistance aux antibiotiques soient un élément essentiel de la recherche en biologie synthétique et en biotechnologie microbienne, il existe peu de méthodes de contrôle dynamique de leur expression. La capacité de contrôler la résistance aux médicaments dans l'espace et dans le temps pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la recherche en biologie synthétique. Par analogie, lorsque Sheth et al.4 ont développé une origine de réplication inductible - une autre caractéristique omniprésente dans les constructions de biologie synthétique - cela a déclenché de nouveaux domaines de recherche, notamment le stockage de données biologiques5 et le diagnostic de ribocommutation de cellules entières6. Le contrôle spatio-temporel de la résistance aux médicaments pourrait permettre la structuration spatiale dans les biomatériaux vivants7, la sélection de cellules individuelles à partir de systèmes microfluidiques8,9 et une meilleure compréhension du rôle que joue la dynamique dans la résistance clinique aux antibiotiques10. Par exemple, la résistance se propage souvent par des événements de transfert horizontal de gènes11,12, qui sont difficiles à surveiller et à contrôler au niveau d'une seule cellule. De nouveaux systèmes de contrôle offrent le potentiel pour de futures études quantifiant comment différents arrangements spatio-temporels de cellules acquérant une résistance peuvent conduire à une prolifération ou à un effondrement au niveau de la population.

Les méthodes optogénétiques sont un outil puissant et largement utilisé pour contrôler l'expression des gènes13. L'apport de lumière aux cellules peut être régulé dans l'espace et dans le temps et peut être intégré directement dans les flux de travail informatiques14,15. Les systèmes optogénétiques des bactéries ont été utilisés pour contrôler l'expression des gènes pour une variété d'applications13,16, notamment pour piloter le flux métabolique17, réguler le microbiome intestinal18, contrôler la morphologie cellulaire19 et réguler la dynamique de co-culture20. L'utilisation de la lumière pour contrôler la survie des cellules a été au centre de l'ingénierie microbienne dans toutes les espèces. Par exemple, la régulation optogénétique a été utilisée pour contrôler la résistance à la nourséothricine chez Saccharomyces cerevisiae21 et la résistance à la bléomycine chez Yarrowia lipolytica22. Chez Escherichia coli, la lumière a été utilisée pour contrôler la résistance aux antibiotiques via des antibiotiques photo-cages conçus individuellement23 ou en tirant parti de la photosensibilité naturelle de la tétracycline24. Cependant, comme ces méthodes nécessitent une ingénierie soigneuse des protéines ou exploitent des propriétés spécifiques à un seul médicament, elles ne se généralisent pas facilement à différents mécanismes de résistance. Une approche alternative utilisait un promoteur inductible par la lumière pour contrôler de manière réversible la résistance au chloramphénicol20,25. Une telle méthode pourrait être généralisée à d'autres gènes de résistance, mais les expériences se sont limitées au contrôle de l'enzyme chloramphénicol acétyltransférase. La plate-forme idéale pour la résistance inductible par la lumière serait à la fois généralisable pour différents gènes de résistance aux antibiotiques et réglable à travers les concentrations d'antibiotiques pour permettre de manière flexible diverses études en biologie synthétique et en microbiologie.

Pour répondre à ces besoins, nous avons utilisé la recombinase Cre inductible par la lumière bleue OptoCreVvd2 pour activer les gènes de résistance aux antibiotiques26. En utilisant ce système, nous excisons un terminateur de transcription flanqué de loxP entre un gène et un promoteur, permettant une expression génique accrue après exposition à une lumière bleue de 465 nm (Fig. 1a). La technologie de recombinase a été utilisée avec succès pour une variété d'applications qui nécessitent un contrôle robuste et inductible de l'expression génique, y compris les circuits logiques géniques et le suivi de la lignée cellulaire27,28,29. Nous avons sélectionné ce système pour son temps d'activation relativement court, sa flexibilité dans la conception de la construction (ne nécessitant que l'ajout de sites loxP) et son expression basale minimale dans les cellules non induites26. De plus, l'interrupteur permanent OFF-ON causé par Cre permet la sélection de cellules résistantes à tout moment après l'exposition à la lumière, permettant une mémoire cellulaire après la suppression de l'entrée de lumière. Bien que cette irréversibilité ne permette pas une dynamique temporelle complexe, l'induction unique offre des avantages qui peuvent être avantageux dans certaines applications telles que permettre une activation irréversible avant qu'une culture ne devienne trop dense pour la pénétration de la lumière, ou minimiser l'exposition dans les souches sensibles à la lumière.

a Les fragments de recombinase Split Cre sont liés à des domaines photodimères Vvd inductibles par la lumière bleue. Lorsqu'il est exposé à la lumière bleue, Cre devient actif et peut exciser un terminateur de transcription entre deux domaines loxP, permettant une expression accrue de la bêta-lactamase (bla). L'expression d'OptoCre-bla permet alors aux cellules de survivre en présence de l'antibiotique carbénicilline. b Courbes de concentration minimale inhibitrice (CMI) des constructions OptoCre-bla intégrées au chromosome et cultivées dans de la carbénicilline pendant 18 h. Les échantillons induits par la lumière ont été exposés à la lumière bleue pendant 2 h immédiatement avant l'exposition à la carbénicilline. Croissance mesurée par DO600 (n = 3). Les souches dans les conditions d'obscurité et de lumière contiennent la construction d'induction de résistance et OptoCreVvd2. Les cellules témoins (-) contiennent la construction d'activation de résistance mais pas de recombinase Cre. Les cellules témoins (+) contiennent un gène bla exprimé de manière constitutive. Les cellules de type sauvage (WT) sont MG1655 sans modification ni plasmides. c Croissance dans le temps des constructions d'activation de la résistance OptoCre-bla à différentes concentrations de carbénicilline. d Nombre d'unités formant colonies (UFC) des cultures à partir des données MIC (n = 6). Après croissance dans la carbénicilline pendant 18 h, les échantillons ont été déposés sur des plaques de gélose et les colonies ont été comptées le lendemain. e Conditions optimales d'activation d'OptoCre-bla. Les constructions d'activation de la résistance se développent dans 300 µg/mL de carbénicilline après exposition à la lumière bleue pendant 2 h, mais pas lorsqu'elles sont conservées dans l'obscurité. La croissance est quantifiée par DO600 après 18 h. Les barres d'erreur montrent l'écart type autour de la moyenne (n = 3 répétitions biologiques).

Ici, nous avons utilisé Cre pour induire l'expression de quatre gènes de résistance aux antibiotiques, que nous avons sélectionnés pour leur ubiquité dans les applications de biologie synthétique ainsi que pour leur gamme de mécanismes d'action (tableau 1). Plus précisément, nous avons choisi le gène de résistance à la carbénicilline/ampicilline bêta-lactamase (bla), qui est à la fois cliniquement pertinent et largement utilisé en biologie synthétique. Les antibiotiques bêta-lactamines inhibent la biosynthèse de la paroi cellulaire et sont dégradés par voie enzymatique par l'enzyme bêta-lactamase12,30,31. Nous avons également inclus la kanamycine nucléotidyltransférase (knt), qui fournit une résistance enzymatique contre la kanamycine, un antibiotique qui provoque une mauvaise traduction par la sous-unité ribosomique 30S32. La chloramphénicol acétyltransférase (cat) fournit une résistance enzymatique contre le chloramphénicol, qui interfère avec la sous-unité ribosomale 50S pour provoquer le blocage de la synthèse des protéines33. Enfin, nous avons inclus la pompe d'efflux de tétracycline A (tetA) en tant que mécanisme de résistance non enzymatique basé sur l'efflux34. La tétracycline se lie à la sous-unité ribosomale 30S pour inhiber la synthèse des protéines35. Ces quatre antibiotiques comprennent à la fois des médicaments bactéricides (carbénicilline/ampicilline et kanamycine) et bactériostatiques (chloramphénicol et tétracycline). Cette sélection de mécanismes de résistance montre à la fois la grande variété de mécanismes qui peuvent être contrôlés à l'aide de ce système et introduit de multiples options pour les outils synthétiques qui peuvent être incorporés dans les systèmes bactériens existants.

Lors du contrôle de l'expression des gènes de résistance aux antibiotiques, les paramètres de performance clés incluent les niveaux d'expression non induits et induits. Par exemple, lors de l'utilisation d'enzymes puissantes comme les bêta-lactamases, même une petite quantité d'expression basale peut permettre la croissance bactérienne en présence d'un antibiotique. De plus, l'expression dans l'état induit devrait également être suffisante pour fournir une résistance à des concentrations de médicament comparables aux plages de travail typiques de l'antibiotique, qui pourraient encore varier entre les cas d'utilisation. Pour optimiser ces deux fonctionnalités dans notre plate-forme, nous avons fait varier le nombre de copies du gène, le promoteur, le site de liaison du ribosome (RBS) et la séquence codante pour régler la concentration minimale inhibitrice (MIC) de l'antibiotique à laquelle les cellules survivent après exposition à la lumière bleue, tout en maintenant des niveaux d'expression basaux suffisamment bas pour éviter de déclencher par erreur la survie. Nous avons en outre démontré l'activation en direct des gènes de résistance et caractérisé les réponses cellulaires à l'aide d'une microscopie unicellulaire accélérée.

Enfin, nous avons démontré l'utilité de la résistance inductible par la lumière dans une application biotechnologique en co-exprimant des gènes de résistance avec la thioestérase hétérologue CpFatB1 pour augmenter la production d'acide octanoïque, un acide gras à chaîne moyenne. Les acides gras à chaîne moyenne sont des produits biochimiques de grande valeur utilisés dans les carburants, la production de polymères, les arômes et les parfums, ce qui en fait des cibles clés de l'ingénierie métabolique36,37. Cependant, l'induction de CpFatB1 est métaboliquement éprouvante, un problème courant avec l'expression d'enzymes hétérologues pour des applications de bioproduction. Ce défi a incité les chercheurs à développer des systèmes où le moment de l'expression de la voie peut être réglé avec précision pour équilibrer le compromis entre la croissance et la production38,39. Par exemple, l'induction lumineuse a été utilisée pour augmenter la production d'autres produits chimiques dans E. coli, tels que le mévalonate et l'isobutanol40. Dans notre système avec OptoCreVvd2, l'induction lumineuse de CpFatB1 couplée à une sélection antibiotique pour une expression élevée de l'enzyme hétérologue a considérablement augmenté la production d'acides gras par rapport à l'induction lumineuse de CpFatB1 seul.

Cette boîte à outils de gènes de résistance inductibles par la lumière soutient et étend la longue utilisation des antibiotiques en tant que mécanismes de contrôle cellulaire en biologie synthétique, ajoutant un mécanisme de contrôle spatial et temporel aux systèmes existants et préparant le terrain pour de futures applications où la lumière est utilisée en combinaison avec des antibiotiques pour permettre un contrôle flexible du comportement et de la survie des cellules.

Pour le contrôle optogénétique des gènes de résistance, nous avons utilisé la recombinase Cre fractionnée inductible par la lumière bleue OptoCreVvd226. Ce système permet l'excision d'éléments génétiques placés entre les sites loxP lorsque les cellules sont exposées à la lumière bleue. L'excision peut être complétée en ~ 2 h, ce qui est comparable ou plus rapide que de nombreux systèmes optogénétiques bactériens existants19,25,41,42. Nous avons utilisé OptoCreVvd2 pour exciser un terminateur de transcription placé à l'intérieur des sites loxP entre un promoteur et un gène de résistance aux antibiotiques, permettant l'expression du gène de résistance uniquement après exposition à la lumière bleue.

Nous avons d'abord utilisé ce système pour contrôler la transcription du gène de résistance à la bêta-lactamase (bla) (que nous désignons par «OptoCre-bla», Fig. 1a). Les antibiotiques bêta-lactamines, y compris l'ampicilline et la carbénicilline, inhibent la biosynthèse de la couche de peptidoglycane dans la paroi cellulaire bactérienne. Les enzymes bêta-lactamases peuvent inactiver les antibiotiques bêta-lactamines en hydrolysant le cycle bêta-lactamine sur l'antibiotique43. Pour ces études, nous avons utilisé la bêta-lactamase TEM-116, qui est couramment utilisée dans les cassettes de résistance aux antibiotiques pour la sélection des plasmides44. Nous avons intégré cette construction génétique après nupG dans le chromosome E. coli MG1655.

Pour mesurer la résistance aux antibiotiques induite par la lumière, nous avons exposé des cultures d'OptoCre-bla à la lumière bleue pendant 2 h, puis les avons cultivées pendant la nuit en présence de carbénicilline et avons comparé la croissance aux cultures maintenues dans l'obscurité. Nous avons observé des différences de prolifération cellulaire dépendant de la lumière bleue, où la CMI nécessaire pour empêcher la croissance était de 300 µg/mL pour les cultures maintenues dans l'obscurité et de 1200 µg/mL pour les cultures exposées à la lumière bleue (Fig. 1b). Les cellules témoins négatives (- témoins) avec uniquement le rapporteur et aucune recombinase Cre avaient une survie comparable à celle des cellules avec la construction complète cultivée dans l'obscurité, indiquant une faible expression de bla à l'état non induit. Les cellules de contrôle positif (+ contrôle) avec l'expression constitutive de bla à partir de son promoteur natif et de RBS se sont développées à toutes les concentrations de carbénicilline testées, y compris à des niveaux supérieurs à la souche inductible par la lumière, comme prévu pour une souche totalement résistante exprimant le gène de résistance dans son contexte natif. Nous avons en outre inclus E. coli MG1655 comme témoin négatif de type sauvage, qui ne s'est développé dans aucune concentration de carbénicilline utilisée ici.

Pour confirmer que les cellules induites par la lumière bleue se développent à des taux comparables à la souche témoin positive, nous avons recueilli des données de séries chronologiques démontrant des taux de croissance normaux dans une large gamme de concentrations de carbénicilline pour les cellules cultivées à la lumière bleue, tandis que les cellules sans induction lumineuse n'ont pas réussi à se développer (Fig. 1c). Nous avons en outre validé les données MIC basées sur la densité optique en utilisant le nombre d'unités formant colonies (UFC) après exposition aux antibiotiques (Fig. 1d). Bien que les données MIC constituent une évaluation précise de la croissance cellulaire en présence d'antibiotiques, les antibiotiques bêta-lactamines provoquent également une filamentation cellulaire, ce qui peut augmenter les lectures de densité optique (DO) même lorsque les cellules ne se divisent pas, ce qui rend la résistance au bla particulièrement importante à confirmer par la mesure des UFC45. Cependant, nos résultats utilisant le nombre d'UFC confirment que les mesures de densité optique se traduisent également par une nette différence de survie cellulaire46. Dans l'ensemble, nous avons constaté qu'OptoCreVvd2 peut être utilisé pour induire une résistance à la bêta-lactamase et nous avons identifié des concentrations de carbénicilline avec des différences robustes entre l'expression activée par la lumière bleue et l'obscurité de la construction du gène de résistance bla (Fig. 1e et Tableau 2).

Nous avons ensuite cherché à généraliser ce système à d'autres gènes de résistance aux antibiotiques. Bien que l'excision d'un terminateur puisse facilement coupler la lumière à l'expression d'un gène de résistance aux antibiotiques, ce n'est pas la même chose que la survie inductible par la lumière. Le contrôle de la survie nécessite une expression nulle ou faible du gène de résistance aux antibiotiques dans l'obscurité, de sorte que les cellules restent sensibles aux antibiotiques. La conception exige également que l'induction du gène de résistance soit suffisante pour conférer une résistance. Les seuils pour ces deux caractéristiques peuvent varier considérablement avec différents mécanismes de résistance aux antibiotiques, qui ont des taux différents de dégradation et d'exportation des antibiotiques. Ainsi, alors que des travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré qu'OptoCreVvd2 peut contrôler l'expression d'une protéine fluorescente avec une faible expression basale et un changement de 10 fois avec la lumière26, le remplacement naïf du gène de fluorescence par un gène de résistance aux antibiotiques peut ne pas produire le comportement souhaité. Par conséquent, nous avons défini un processus général pour adapter le système OptoCreVvd2 à différents gènes de résistance aux antibiotiques (bla, knt, cat et tetA) et avons pu montrer la survie à des plages personnalisées de concentration d'antibiotiques.

Pour généraliser notre système à d'autres antibiotiques, nous avons commencé par échanger bla contre la kanamycine nucléotidyltransférase (knt) dans notre construction d'induction pour fabriquer OptoCre-knt (Fig. 2a). L'antibiotique kanamycine provoque une erreur de traduction en se liant à la sous-unité 30S du ribosome bactérien. L'enzyme knt catalyse le transfert d'un nucléotide vers la kanamycine, inactivant l'antibiotique32. Bien que notre conception initiale d'OptoCre-knt ait montré une activation de la résistance à l'aide de la lumière, la concentration de kanamycine requise pour voir cette différence était très élevée - plus de 1000 µg/mL (Fig. 2b), par rapport à 25 à 50 μg/mL couramment utilisée pour la propagation plasmidique24,44. Bien qu'il ne soit pas essentiel de faire correspondre les concentrations de travail courantes d'antibiotiques, l'utilisation de concentrations proches de ces plages offre des avantages, notamment la possibilité d'étudier les effets sur la communauté à des concentrations physiologiques et de limiter les besoins globaux en antibiotiques.

a Les niveaux d'expression du gène de résistance à la kanamycine knt peuvent être ajustés en modifiant la force du promoteur et du RBS, ainsi que l'origine de la réplication. La force du promoteur varie de P (moyen) à P* (moyen-faible) à P** (faible). La force RBS varie de R (fort) à R* (faible). b Courbes CMI des cassettes d'activation OptoCre-knt sur le chromosome, avec le promoteur P, P* ou P** et RBS R ou R* (n = 3). c Courbes CMI des cassettes d'activation OptoCre-knt sur un plasmide avec l'origine de réplication p15A (n = 3). d Conditions d'activation optimales d'OptoCre-knt, en utilisant P* et R sur le chromosome à 300 µg/mL de kanamycine. La croissance est quantifiée par DO600 après 18 h. Les barres d'erreur montrent l'écart type autour de la moyenne (n = 3 répétitions biologiques).

Ainsi, nous avons entrepris d'ajuster l'expression des gènes en optimisant l'architecture génétique entourant le gène. Pour réduire l'expression basale, nous avons affaibli le promoteur ou RBS conduisant l'expression de knt. En modifiant le promoteur et le RBS d'OptoCre-knt, nous avons pu modifier l'expression du gène de résistance pour permettre la survie à des concentrations d'antibiotiques beaucoup plus proches de la CMI du MG1655 de type sauvage (Fig. 2b). Nous avons testé une gamme de combinaisons de promoteurs et de RBS pour montrer comment ces altérations ont un impact sur la survie à différentes concentrations d'antibiotiques. Nous avons utilisé des promoteurs constitutifs de force variable, tous basés sur le promoteur viral T7A1, allant d'une force transcriptionnelle moyenne, P, à moyenne-faible, P*, à faible, P**. Nous avons également utilisé le RBS du gène 10 dans le phage T747, que nous désignons R, et un RBS que nous avons conçu informatiquement pour être plus faible48, que nous désignons R* (Fig. 2a). Le changement de P en P * a réduit la CMI pour l'état sombre à 200 µg / ml de kanamycine, tandis que P ** l'a encore réduite à 150 µg / ml (Fig. 2b). La CMI pour l'état clair a également été réduite, comme prévu, mais a toujours maintenu une large gamme de concentrations de kanamycine entraînant la survie. Avec P*, des niveaux de kanamycine entre 200 et 800 µg/mL ont entraîné une survie induite par la lumière, tandis que pour P**, la plage était de 150 à 500 µg/mL. L'utilisation de R* en combinaison avec P a entraîné une diminution spectaculaire à la fois de la CMI à l'état sombre et des concentrations efficaces pour la survie induite par la lumière, ce qui a entraîné une plage étroite entre 4 et 6 µg/mL de kanamycine.

Bien que les constructions intégrées sur le plan chromosomique utilisées jusqu'à présent présentent les avantages d'une faible expression de fond et ne nécessitent pas de marqueur de sélection, les plasmides offrent leurs propres avantages pour les systèmes de résistance inductibles par la lumière. De nombreux gènes de résistance se trouvent naturellement sur les plasmides, et une origine plasmidique permet un transfert pratique de systèmes entre différentes souches. Nous avons en outre caractérisé nos constructions sur des plasmides contenant l'origine de réplication p15A, qui compte environ dix copies par cellule (Fig. 2c)49. Le passage de l'intégration chromosomique à un plasmide p15A a augmenté de plus de 5 fois la plage de concentrations d'antibiotiques auxquelles les cellules contenant OptoCre-knt survivent sélectivement. Malgré cette augmentation, nous avons constaté que des stratégies telles que la diminution de la force du promoteur ou de la RBS peuvent avoir un effet de contrepoids. Nous avons également caractérisé un OptoCre-bla à base de plasmide p15A, mais sa résistance basale était trop élevée pour être considérée comme fonctionnelle (Fig. 1a supplémentaire). Dans l'ensemble, le système à base de plasmide avec OptoCre-knt supprime le besoin du processus d'insertion chromosomique, augmentant la facilité avec laquelle ces constructions peuvent être utilisées dans différentes souches ou contextes.

La flexibilité offerte par ces différentes conceptions nous a amenés à développer plusieurs constructions, et la construction optimale est susceptible d'être spécifique à l'application. Par exemple, les concentrations inférieures indiquées ici sont proches du MIC de type sauvage, ce qui est optimal pour les études visant à caractériser l'acquisition de résistance à l'aide de concentrations d'antibiotiques phénotypiquement pertinentes. En revanche, les concentrations plus élevées permettent une sélection cellulaire plus stricte pour les études où seules les cellules activées devraient survivre. Grâce à ce processus d'optimisation, nous avons trouvé des constructions qui permettent un plus grand changement de pli de la kanamycine MIC entre les cultures sombres et exposées à la lumière par rapport à notre construction d'origine, notamment P * et R conduisant l'expression d'OptoCre-knt sur le chromosome est un exemple idéal de notre conception optimisée (Fig. 2d et Tableau 2).

La survie induite par la lumière nécessite un état OFF étroit où les cellules sont sensibles aux antibiotiques. Comme nous l'avons démontré, cela peut être réalisé avec une faible expression basale du gène de résistance. Cependant, l'état non induit peut également être minimisé si l'enzyme de résistance elle-même est plus faible. Ainsi, lors de l'activation de l'enzyme chloramphénicol acétyltransférase (cat), nous avons profité d'une mutation connue pour diminuer la force de l'enzyme elle-même. Le chloramphénicol empêche la synthèse des protéines en se liant à la sous-unité ribosomale 50S, où il inhibe la formation de liaisons peptidiques. L'enzyme cat empêche le chloramphénicol de se lier au ribosome en attachant un groupe acétyle de l'acétyl-CoA à l'antibiotique50. En utilisant la variante catT172A plus faible51,52, nous avons réduit la concentration d'antibiotique à laquelle les cellules survivent (Fig. 3a). Dans la conception OptoCre-cat, nous avons utilisé le promoteur P et RBS R, et comparé la survie induite par la lumière par cat et catT172A. Ici, nous avons observé une diminution plus nette de la résistance à l'état OFF sombre avec catT172A par rapport au chat, abaissant la résistance basale à celle de la souche de type sauvage sur une construction intégrée sur le plan chromosomique (Fig. 3b). Nous avons également observé une diminution des valeurs de CMI pour cat et catT172A sur une origine plasmidique p15A (Fig. 3c). Cette approche mutante enzymatique de l'optimisation peut être particulièrement utile lorsque vous travaillez avec des enzymes qui présentent une résistance à des concentrations élevées d'antibiotiques même avec une expression génique basale minimale, ou si vous utilisez ce système sur un plasmide avec un nombre de copies élevé où il est difficile de limiter l'expression basale. Cette approche crée un autre point auquel les niveaux de résistance peuvent être affinés, et la différence de croissance induite par la lumière montrée par catT172A sur une origine plasmidique p15A est une conception optimisée particulièrement polyvalente (Fig. 3d et Tableau 2).

a La résistance donnée par le gène de résistance au chloramphénicol cat peut être diminuée en utilisant le variant catT172A sur une origine chromosomique ou plasmidique. b Courbes CMI de la cassette d'activation OptoCre-cat avec l'enzyme native cat ou l'enzyme affaiblie catT172A sur le chromosome (n = 3). c Courbes CMI des cassettes d'activation cat et catT172A sur un plasmide d'origine p15A (n = 3). d Conditions d'activation optimales, en utilisant catT172A avec le promoteur P et RBS R sur une origine plasmidique à 75 µg/mL de chloramphénicol. La croissance est quantifiée par DO600 après 18 h. Les barres d'erreur montrent l'écart type autour de la moyenne (n = 3 répétitions biologiques).

Nous nous sommes demandé s'il serait possible d'ajuster les niveaux de résistance en ajustant les propriétés d'exposition à la lumière. Pour tester cela, nous avons en outre caractérisé la conception OptoCre-cat en modifiant la durée et l'intensité de l'exposition à la lumière (Fig. 2 supplémentaire). Nous avons constaté que les niveaux de résistance étaient ajustables et dépendaient d'une combinaison de la durée d'exposition à la lumière et de l'intensité de la lumière bleue.

Un problème commun à bon nombre de nos conceptions est que l'expression basale entraîne des niveaux de résistance qui, bien que faibles, dépassent toujours ceux observés dans la souche de type sauvage. En principe, cette fuite pourrait être le résultat de plusieurs problèmes différents, notamment des événements de recombinaison spontanée, des mutations dans le terminateur ou la lecture du terminateur. Nous avons séquencé le loxP et la région de terminaison de la souche témoin (-) sans Cre à la fois dans des conditions de chloramphénicol de 0 µg/mL et de chloramphénicol de 75 µg/mL, où cette dernière représente la condition de concentration d'antibiotique la plus élevée qui a montré une croissance. Les résultats de séquençage des deux conditions correspondaient à la séquence d'origine du plasmide, confirmant que l'expression qui fuit n'est pas le résultat d'une recombinaison spontanée ou de mutations de terminaison. Ces résultats sont conformes aux caractérisations de la conception originale d'OptoCreVvd2, qui a montré une faible expression basale constante d'un fluorophore sans preuve de recombinaison spontanée26. Pour atténuer le potentiel de lecture du terminateur, nous avons ensuite tenté de réduire l'expression basale en remplaçant le terminateur fort BBa_B0015 de notre conception originale par le terminateur synthétique L3S2P21, qui était le terminateur le plus fort identifié dans un ensemble étendu caractérisé par Chen et al.53. Cependant, cela n'a pas montré d'amélioration supplémentaire par rapport au terminateur utilisé dans notre conception initiale (Fig. 3 supplémentaire), nous n'avons donc pas poursuivi cette voie plus loin. Pour les applications où une expression basale minimale est essentielle, des conceptions alternatives pourraient tester d'autres terminateurs53,54 ou différentes approches de conception de circuit55,56,57.

L'induction lumineuse peut également être appliquée à des mécanismes de résistance aux antibiotiques non enzymatiques, tels que la pompe à efflux tetA. L'antibiotique tétracycline se lie de manière réversible à la sous-unité ribosomale 30S, inhibant la synthèse des protéines. La pompe à efflux tetA se localise sur la membrane interne et exporte les complexes magnésium-chélate de tétracycline en important un proton35. Contrairement à bla, knt et cat où les niveaux de résistance native étaient élevés et nos efforts d'ingénierie visant à réduire la puissance, nous avons constaté que notre conception initiale pour tetA inductible ne présentait pas de résistance par rapport au MG1655 de type sauvage lorsqu'il était exprimé avec le promoteur P et RBS R sur un plasmide d'origine p15A (Fig. 1b supplémentaire), conditions qui produisaient les niveaux de résistance les plus élevés dans les constructions que nous avons testées précédemment. Pour compenser cela, nous avons choisi d'utiliser le puissant promoteur natif Ptet avec son RBS Rtet correspondant pour permettre l'expression complète du gène tetA58 afin de créer OptoCre-tetA (Fig. 4a). En utilisant cette architecture native, OptoCre-tetA a montré une certaine activation lors de l'intégration chromosomique (Fig. 4b) et a montré une forte activation sur l'origine du plasmide p15A (Fig. 4c). Notamment, la résistance basale à l'état sombre par rapport au MG1655 de type sauvage était minime, permettant l'activation d'OptoCre-tetA à de faibles concentrations de tétracycline. Ainsi, nous avons constaté que la version à base de plasmide p15A est une construction idéale pour la résistance à la tétracycline (Fig. 4d et Tableau 2).

un gène de résistance à la tétracycline tetA est exprimé à l'aide du promoteur natif Ptet et du RBS Rtet natif, pour permettre une expression maximale du gène. b Courbes CMI d'OptoCre-tetA sur le chromosome et l'origine du plasmide c p15A (n = 3). d Conditions d'activation optimales d'OptoCre-tetA, en utilisant l'origine du plasmide p15A à 4 µg/mL de tétracycline. La croissance est quantifiée par DO600 après 18 h. Les barres d'erreur montrent l'écart type autour de la moyenne (n = 3 répétitions biologiques).

La précision spatiale et temporelle permise par l'optogénétique permet à ces constructions d'être utilisées pour une variété d'applications, y compris des études unicellulaires de la résistance bactérienne aux antibiotiques. Comment l'acquisition de résistance conduit à la survie bactérienne au niveau de la cellule unique est d'un intérêt particulier dans le contexte du transfert horizontal de gènes. Les études existantes sur le transfert de gène horizontal unicellulaire ont déjà caractérisé les taux de transfert de gène et montré des liens importants avec la détection du quorum59,60. Cependant, les cas naturels de transfert horizontal de gènes sont peu fréquents et difficiles à contrôler dans l'espace et dans le temps, en particulier par rapport à l'exposition aux antibiotiques. Des études antérieures ont également montré que l'acquisition stochastique de résistance dans des cellules individuelles n'est pas toujours suffisante pour provoquer la prolifération de cellules phénotypiquement résistantes61. Pour étudier quand les événements de transfert horizontal de gènes conduisent à la propagation de la résistance dans les populations, il serait intéressant de modéliser l'acquisition de résistance d'une seule cellule avec un contrôle optogénétique de la sensibilité aux antibiotiques. Cela pourrait être utilisé pour caractériser quand et comment l'acquisition de résistance dans des cellules individuelles conduit à l'évasion antibiotique, et comment les schémas posologiques et les concentrations spécifiques d'antibiotiques ont un impact sur la fréquence d'évasion.

Ici, nous montrons une preuve de concept pour les premières étapes de cette classe d'études en induisant la croissance cellulaire à l'aide de la lumière bleue pour les cellules sur des tampons d'agarose. À l'aide de la microscopie accélérée, nous avons placé des cellules contenant une résistance aux antibiotiques activable par la lumière sur des tampons d'agarose contenant des antibiotiques et comparé la croissance des cellules maintenues dans l'obscurité à celles exposées à la lumière bleue. Pour ces études, nous avons choisi de nous concentrer sur un sous-ensemble de gènes de résistance, en sélectionnant la kanamycine et le chloramphénicol comme exemples d'antibiotiques bactéricides et bactériostatiques, respectivement. Nous avons caractérisé l'activation de la résistance pour la résistance OptoCre-knt intégrée dans le chromosome à la kanamycine (Fig. 5a et film supplémentaire 1) et la résistance OptoCre-cat à base de plasmide au chloramphénicol (Fig. 5b et film supplémentaire 2). Nous avons constaté que les cellules présentant une résistance induite par la lumière présentaient un court délai avant la croissance par rapport à leurs témoins positifs constitutivement résistants, ce qui correspond probablement au temps nécessaire pour exciser le terminateur de transcription et permettre l'expression du gène de résistance. En revanche, lorsque les cellules étaient maintenues dans l'obscurité, la croissance était inhibée et nous avons observé des exemples de perte d'intégrité de la membrane (film supplémentaire 1–2). Pour quantifier la récupération des cellules induites par la résistance, nous avons calculé le pourcentage de cellules dans le cadre initial qui se sont rétablies au cours du film (Fig. 4 supplémentaire). Nous avons défini le moment de la récupération comme le moment où une cellule se divise pour la première fois et avons trouvé une récupération de 70 % pour OptoCre-knt et de 42 % pour OptoCre-cat avec une exposition à la lumière (contre 13 % et 4 % pour les cellules dans l'obscurité, bien que les cellules dans l'obscurité aient rarement connu plus d'un événement de division, Film supplémentaire 1–2). Bien que ces données montrent des différences claires entre l'exposition à la lumière et à l'obscurité, les taux incomplets de récupération sous exposition à la lumière peuvent être dus à une exposition simultanée à l'antibiotique et à la lumière, rendant probablement certaines cellules non viables avant qu'elles ne puissent être induites. À l'avenir, des expériences microfluidiques pourraient aider à évaluer les taux de récupération en fonction de l'induction lumineuse relative et du moment de l'ajout d'antibiotiques.

Activation d'une construction de résistance chromosomique OptoCre-knt avec le promoteur P* et RBS R sur des tampons d'agarose contenant 400 µg/mL de kanamycine, et b la construction de résistance OptoCre-cat à base de plasmide p15A utilisant catT172A avec le promoteur P et RBS R sur des tampons d'agarose contenant 60 µg/mL de chloramphénicol. Les images de microscopie montrent des échantillons représentatifs des souches d'activation de la résistance dans l'obscurité ou avec une lumière bleue (barre d'échelle = 2 µm). Le nombre de cellules au fil du temps est cumulatif sur plusieurs positions d'imagerie pour chaque condition, chaque parcelle contenant la souche de résistance OptoCre ainsi que des contrôles négatifs et positifs (n = 3 répétitions biologiques).

En ce qui concerne les applications futures nécessitant le contrôle de sous-populations de cellules, nous avons également utilisé un dispositif numérique à micromiroir (DMD)62 pour activer la résistance dans un sous-ensemble de cellules. Le DMD permet un éclairage programmé de zones spécifiques dans un champ de vision. Nous avons éclairé la moitié du champ de vision et constaté une activation préférentielle des cellules dans la région éclairée par la lumière bleue (Fig. 5 supplémentaire). Nous avons observé une certaine croissance dans un sous-ensemble de cellules dans la moitié sombre du champ de vision, bien qu'à des niveaux réduits par rapport à la moitié éclairée. Cela peut être dû à la diffusion de la lumière du DMD, car nous ne voyons cette activation qu'après le début de l'éclairage du DMD. Par rapport aux expositions d'intensité plus longue et plus faible que nous avons utilisées dans les expériences de culture liquide, le DMD est conçu pour fournir des périodes de lumière intenses. Ces différences suggèrent que les protocoles et les configurations d'activation DMD pourraient être optimisés pour un meilleur timing d'activation à l'avenir.

Pour démontrer l'utilité du système pour les applications biotechnologiques, nous nous sommes ensuite concentrés sur l'augmentation du rendement en acide octanoïque grâce à la co-expression de cat ou tetA avec la thioestérase CpFatB1 (Fig. 6a-b). CpFatB1 est dérivé de l'espèce végétale Cuphea palustris et a été optimisé pour l'expression dans E. coli63. L'expression de CpFatB1 pèse sur les cellules. Par conséquent, le couplage direct de son expression induite avec la résistance aux antibiotiques peut permettre une croissance sélective de cellules produisant activement les deux enzymes, empêchant ainsi la croissance de cellules non exprimantes (Fig. 6c). Nous avons utilisé OptoCre-cat avec le mutant catT172A et OptoCre-tetA pour la sélection en raison de leurs larges plages d'induction et de leurs résistances basales minimales sur le squelette du plasmide p15A. Pour la production d'acides gras, nous avons utilisé la variante hautement active CpFatB1.2-M4-287, dont il a déjà été démontré qu'elle stimule la production d'acide octanoïque63. Pour optimiser l'expression du gène CpFatB1 sans perturber l'architecture d'activation de la résistance, nous l'avons placé immédiatement en aval du gène de résistance sous l'expression d'un RBS puissant conçu par ordinateur et noté R'. Conformément au protocole d'induction de la résistance aux antibiotiques seuls, nous avons effectué l'induction en exposant les cellules à la lumière bleue pendant 2 h au début de la phase de croissance. Du point de vue de la bioproduction, un avantage du système OptoCreVvd est son irréversibilité, qui permet une activation permanente de CpFatB1 sans nécessiter d'éclairage continu. Cela contourne les problèmes avec les systèmes d'induction de lumière dynamique, où la pénétration de la lumière peut devenir une préoccupation pour les cultures de cellules denses dans des contextes d'ingénierie métabolique40,64. Nous avons constaté que l'induction lumineuse seule entraînait une augmentation significative de la production d'acide octanoïque pour les systèmes cat et tetA. Nous nous sommes ensuite demandé si l'introduction de la sélection antibiotique pouvait encore améliorer les rendements. Nous avons constaté qu'avec OptoCre-cat, l'ajout de 150 µg/mL de chloramphénicol améliorait considérablement la production, l'augmentant de 29 % par rapport à la condition d'induction lumineuse uniquement, avec des concentrations de chloramphénicol plus élevées entraînant des performances similaires (Fig. 6d). L'induction lumineuse seule ou avec un antibiotique a également montré une amélioration substantielle du rendement par rapport à une version exprimée de manière constitutive de CpFatB1 avec une architecture génétique identique et une expression constitutive de la recombinase Cre (Fig. 6d). Avec OptoCre-tetA, la production d'acide octanoïque a augmenté de 150 % par rapport à l'induction lumineuse seule lorsqu'elle a été complétée par 1,5 µg/mL de tétracycline (Fig. 6e). Des concentrations plus élevées de tétracycline ont encore amélioré le rendement, atteignant une augmentation de 300 % par rapport à la lumière seule lorsque 6 µg/mL de tétracycline ont été ajoutés. Ces concentrations se situent dans la fourchette supérieure des niveaux de résistance que nous observons dans nos expériences MIC pour les souches respectives, probablement en raison de la DO plus élevée (OD600 ≈ 0,6) au moment où les antibiotiques sont ajoutés dans notre protocole de bioproduction. Le système d'induction avec OptoCre-tetA n'a pas stimulé la production par rapport à l'expression constitutive de CpFatB1, bien que l'ajout d'antibiotique ait considérablement amélioré le rendement par rapport à la lumière seule (Fig. 6e). Il est important de noter que les versions exprimées de manière constitutive des constructions cat et tetA ont montré des profils de croissance médiocres par rapport aux versions inductibles par la lumière (Fig. 6 supplémentaire). Ce déficit de croissance dans les constructions constitutives est problématique, car il peut conduire à des mutants échappés et réduire la stabilité des souches de production. Ainsi, le couplage de la production d'acide octanoïque avec la sélection de la résistance conduit à des rendements plus élevés en acide octanoïque que l'induction lumineuse seule, sans le déficit de croissance imposé associé à la production continue.

a L'activation d'OptoCre-cat à l'aide de catT172A ou b OptoCre-tetA est couplée à CpFatB1 en introduisant le gène en aval du marqueur de résistance aux médicaments sous le fort RBS R'. c La lumière bleue induit l'expression du gène de résistance et de CpFatB1, mais ne garantit pas que tous les individus d'une communauté expriment les gènes. Les non-producteurs ont un avantage de croissance en raison de la charge de CpFatB1. L'ajout de chloramphénicol empêche la croissance de tout individu ne produisant pas le gène de résistance et par conséquent CpFatB1. d Production d'acide octanoïque couplée à OptoCre-cat mesurée par GC-MS. e Production d'acide octanoïque couplée à OptoCre-tetA mesurée par GC-MS. La signification a été déterminée à l'aide d'un test t de Welch bilatéral : *P < 0,05 ; ns non significatif. Les barres d'erreur montrent l'écart type autour de la moyenne (n = 3 répétitions biologiques).

En comparant les constructions OptoCre-cat et OptoCre-tetA, nous avons constaté que si OptoCre-cat montrait une production globale plus élevée, OptoCre-tetA montrait une plus grande augmentation de la production avec des concentrations croissantes d'antibiotiques sur la plage testée. Cela pourrait être dû à la différence entre les types de résistance (enzymatique vs efflux) et leur impact sur la dynamique des populations, ou les différents promoteurs des constructions (P vs Ptet), suggérant que ces constructions et leur induction pourraient probablement être optimisées davantage pour augmenter la production. Ce travail montre le potentiel de l'utilisation de la lumière pour contrôler la résistance aux antibiotiques pour des applications d'ingénierie métabolique et de bioproduction.

Nous avons développé et optimisé des systèmes optogénétiquement contrôlés pour quatre gènes de résistance aux antibiotiques. En utilisant une recombinase Cre inductible par la lumière bleue, nous avons montré l'activation de bla, knt, cat et tetA pour induire une résistance sur une gamme de concentrations d'antibiotiques. Ces gènes de résistance couvrent plusieurs mécanismes et représentent des antibiotiques et des gènes de résistance couramment utilisés dans les laboratoires de biologie synthétique et de microbiologie. Un aspect crucial de la conception d'une résistance inductible est le niveau d'expression dans les états non induit et induit, et les niveaux optimaux varient considérablement avec la force du gène de résistance. Par conséquent, nous avons testé des promoteurs, des RBS et des mutants enzymatiques de force variable pour trouver des constructions qui montrent une expression basale optimale et des changements de pli de l'activation de la résistance. Pour contrôler le nombre de copies au niveau de l'ADN, nous avons également comparé des constructions intégrées dans le chromosome dans la région nupG et sur un plasmide de copie moyenne p15A, ce qui a amélioré la flexibilité de la conception expérimentale. Nous avons constaté que l'optimisation des constructions d'induction de résistance au niveau du promoteur, du RBS, de l'enzyme et du nombre de copies peut être utilisée comme une approche généralisable, offrant de multiples options pour modifier l'expression afin de permettre une flexibilité dans la conception de la construction pour répondre aux contraintes expérimentales. Par exemple, les études qui nécessitent un promoteur natif, une origine plasmidique spécifique ou une protéine de résistance particulière pour être compatibles avec d'autres éléments de la conception de la souche, peuvent être adaptées car ce système est adapté à différents cas d'utilisation ou à d'autres gènes de résistance. Ce système permet également l'expansion des gènes de résistance au-delà de ceux présentés ici, en utilisant les approches d'optimisation mentionnées ci-dessus. De futures expériences caractérisant directement l'expression pourraient également constituer une voie efficace pour optimiser davantage les conceptions. L'utilisation de techniques telles que qPCR ou Western blots pourrait permettre une mesure relative des niveaux de transcription et de traduction, ou des fusions de protéines avec un fluorophore pourraient permettre une mesure dans les cas où la fusion est connue pour ne pas avoir d'impact sur la fonction.

Nous avons sélectionné les quatre mécanismes de résistance aux antibiotiques ici pour qu'ils soient largement applicables à la fois à la biologie synthétique et à la microbiologie. Ces antibiotiques et gènes de résistance sont souvent utilisés comme marqueurs de sélection plasmidique et dans les systèmes de contrôle de la biologie synthétique24,44. À titre d'exemple d'application, ces constructions ont le potentiel d'être appliquées à la sélection unicellulaire dans les systèmes microfluidiques. La sélection de cellules individuelles d'intérêt à partir d'un dispositif microfluidique est un défi, et les méthodes actuelles nécessitent des pièges optiques complexes et des dispositifs microfluidiques basés sur des valves9. La combinaison d'une résistance inductible par la lumière avec un DMD62 pour un ciblage précis de la lumière permettrait la sélection antibiotique d'une lignée cellulaire d'intérêt à partir de la sortie de l'appareil, sans aucune modification de la puce ni exigences matérielles supplémentaires au-delà de l'exposition à la lumière. L'utilisation de la lumière permet également l'intégration dans les flux de travail informatiques, facilitant potentiellement le dépistage et la sélection automatisés des phénotypes d'intérêt. Le commutateur permanent garantirait que le signal de sélection n'est pas perdu, permettant à la progéniture de bactéries sélectionnées d'être récoltée pour la caractérisation à tout moment après l'activation. De plus, étant donné la prévalence des recombinases dans la logique cellulaire, ce système pourrait être intégré de manière modulaire avec des circuits de recombinase plus grands en tant que sortie logique contrôlant la survie des cellules. Par exemple, les gènes de résistance contrôlés par la recombinase pourraient être largement utilisés pour réguler la survie des cellules uniquement si certaines conditions environnementales (par exemple, petite molécule, lumière ou température) sont remplies28. Dans ces cas, il peut être utile d'utiliser une version constitutive d'OptoCreVvd2, plutôt que la version inductible IPTG utilisée ici, pour simplifier le flux de travail et minimiser les exigences d'induction chimique. Comme les recombinases et les gènes de résistance sélectionnés sont couramment utilisés en biologie synthétique, cela permet d'intégrer directement le contrôle optogénétique dans les systèmes génétiques existants.

En outre, nous envisageons que ces gènes de résistance aux antibiotiques inductibles par la lumière soient utiles en tant que système synthétique pour étudier le transfert horizontal de gènes. Ces systèmes sont bien adaptés pour examiner comment les événements d'acquisition de gènes de résistance unicellulaire conduisent à l'expansion ou au déclin de la population. Être capable d'activer de manière permanente "l'acquisition" de gènes de résistance à l'aide de la lumière élimine le besoin de s'appuyer sur des observations d'événements de transfert de gènes horizontaux naturels peu fréquents et stochastiques. Notamment, bla est particulièrement problématique dans les milieux cliniques31, et connu pour être largement transféré lorsque l'intestin est exposé à l'ampicilline12. Des études récentes portant sur des instances unicellulaires de transfert horizontal de gènes ont également montré que la détection de quorum et les structures de biofilm peuvent être importantes pour déclencher des événements de transfert59,60, mais les expériences se sont jusqu'à présent limitées à l'étude d'événements de transfert horizontal peu fréquents. De manière critique, étant donné que tous les événements d'acquisition de résistance ne conduisent pas à la prolifération de populations résistantes61, le contrôle synthétique de l'acquisition de résistance pourrait révéler quand et comment les cellules acquérant une résistance prolifèrent. À l'avenir, ce système pourrait également être modifié pour permettre la désactivation ou le contrôle réversible de la résistance, permettant à la fois l'acquisition de la résistance et les études de perte. L'utilisation de la lumière comme inducteur permet également des études avec la dynamique spatiale, au-delà de ce qui pourrait être réalisé en utilisant l'induction chimique. Cependant, la pénétration de la lumière peut devenir un problème pour les géométries spatiales 3D complexes. Dans l'ensemble, le contrôle spatial et temporel offert par ces systèmes optogénétiques pourrait permettre aux chercheurs de déterminer quels arrangements cellulaires et calendriers de traitement antibiotique conduisent à l'expansion ou à l'effondrement des communautés microbiennes constituées de cellules résistantes et de leurs voisins sensibles61,65.

Ce système offre également de nouveaux avantages aux systèmes de bioproduction synthétique, ce que nous avons démontré dans une étude pilote utilisant CpFatB1 pour augmenter la production d'acide octanoïque. Bien qu'efficaces, l'expression et l'activité enzymatique de CpFatB1 sont éprouvantes à des niveaux élevés, ce qui entraîne un avantage de croissance pour les non-producteurs et peut donner lieu à des tricheurs63,66. En couplant l'expression d'un gène de résistance avec l'enzyme de bioproduction, nous pouvons limiter la croissance aux seules cellules exprimant CpFatB1, augmentant encore le rendement par rapport au système équivalent avec induction lumineuse seule. Ce travail peut être étendu à d'autres enzymes de bioproduction d'intérêt, ou co-exprimé avec plusieurs gènes pour nécessiter l'expression de plusieurs enzymes dans une voie de croissance.

Les gènes de résistance aux antibiotiques sont des outils omniprésents et fondamentaux de la biologie synthétique. Cependant, il existe peu de méthodes actuelles permettant une régulation dynamique de leur expression. La capacité d'activer la résistance à l'aide de la lumière élargit cet outil de base, améliorant le contrôle spatio-temporel et permettant de nouvelles applications dans la sélection cellulaire et l'étude de l'acquisition de la résistance aux antibiotiques.

Tous les tests de résistance aux antibiotiques utilisent la souche E. coli MG1655. Nous avons construit des plasmides en utilisant la méthode d'assemblage Gibson67 ou en utilisant l'assemblage Golden Gate68 dans les cas où les constructions contenaient des fragments de moins de 100 paires de bases de longueur (tableau supplémentaire 1).

Des constructions intégrées sur le plan chromosomique ont été insérées à l'aide du système Lambda Red recombinase1 en aval de nupG (site d'homologie directe : GGTTCTGGCCTTCGCGTTCATGGCGATGTTCAAATATAAACACGT, inverse : GGCGTGAAACGGTTGTACGGTTATGTGTTGAAGTAAGAATAA). Des cassettes de résistance aux antibiotiques flanquées de sites FRT ont été utilisées pour sélectionner des intégrations réussies (nous avons utilisé knt pour les constructions d'activation bla et cat, cat pour les constructions d'activation knt et tetA); ces cassettes ont ensuite été durcies à l'aide d'une recombinase FLP à base de plasmide sur une origine sensible à la température selon le protocole de Datsenko et Wanner1. Enfin, nous avons durci le plasmide sensible à la température avant les expériences ultérieures.

Les plasmides utilisés pour l'expression d'OptoCreVvd2 sont dérivés de Sheets et al.26. Pour les études d'activation de bla, nous avons changé la cassette de sélection de plasmide de bla à cat, en utilisant le gène des plasmides BglBrick44 et les amorces répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Les plasmides d'activation de la résistance aux antibiotiques ont été fabriqués en modifiant le promoteur respectif, RBS, et le gène rapporteur de pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 de Sheets et al.26. Les origines plasmidiques de réplication et les séquences pour bla, knt et cat ont été extraites de la série de plasmides BglBrick44. La mutation catT172A a été extraite de Ciechonska et al.51. La séquence pour tetA a été obtenue à partir du plasmide AddGene #74110 (pRGD-TcR) déposé par Hans-Martin Fischer69. La séquence de CpFatB1.2-M4-287 a été obtenue auprès de Hernández Lozada et al. et synthétisé à l'aide de Twist Bioscience63. Des souches d'expression constitutives CpFatB1.2-M4-287 ont été créées en co-transformant les mêmes rapporteurs utilisés pour les expériences d'expression de la lumière avec pBbE5a-Cre, qui agit de manière constitutive. Toutes les constructions de résistance à base de plasmide contiennent l'origine p15A. Les constructions à base de plasmide pour l'activation de knt contiennent cat comme marqueur de sélection, et les constructions pour l'activation de bla, cat et tetA contiennent knt comme marqueur de sélection de plasmide. Les contrôles positifs pour bla et tetA contiennent le gène respectif avec son promoteur natif et RBS sur un plasmide avec l'origine p15A. Les contrôles positifs pour knt et cat contiennent le gène respectif avec son promoteur natif et RBS sur un plasmide avec l'origine p15A pour les études utilisant un rapporteur à base de plasmide, ou intégré dans la région nupG pour les études utilisant des rapporteurs intégrés chromosomiquement. Les promoteurs utilisés étaient des variants de force moyenne, moyenne-faible et faible de T7 A170, notés P (TTATCAAAAGAGTA TTGCAT TAAAGTCTAACCTATAG GAATCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA), P* (TTATCAAAAGAGTA TTGTCT TAAAGTCTAACCTATAG GATTCT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA) et P** (TTATCAAAAGAGTA TTGTAA TAAAGTCTAACCTATAG GATTTT TACAGCCATCGAGAGGGACACGGCGAA). Les soulignements indiquent des mutations du promoteur T7 A1 d'origine. Le site de liaison du ribosome R est le RBS du gène 10 dans le phage T7 (TTTAAGAAGGAGATACAT)47. R * (ATCACTCTACGGCCAGCTGCAAAC) a été conçu par calcul à l'aide de l'ADN De Novo version 2.1 pour avoir une force de traduction 10 fois plus faible (14,8 AU) par rapport à R (148 AU), et R '(TTTGTTTAATTACTAAGCGGGAGGTTAT) a été conçu pour une force de traduction accrue (100 000 AU)48,71. Le terminateur rrnB BBa_B0015, utilisé dans le pBbAk-W4-loxTTlox-mRFP1 original de Sheets et al.26, a été utilisé comme terminateur flanqué de loxP dans toutes les constructions, sauf indication contraire. Le terminateur synthétique fort L3S2P2153 a été synthétisé par IDT et cloné dans une variante mCherry du plasmide rapporteur fluorescent d'origine. Les amorces utilisées pour modifier chacun de ces éléments sont incluses dans le tableau supplémentaire 1.

Les plasmides et souches de cette étude et leurs séquences sont disponibles sur AddGene (https://www.addgene.org/Mary_Dunlop/).

Les souches ont été cultivées pendant la nuit à partir d'une seule colonie dans un milieu LB sélectif contenant 100 μg/mL de carbénicilline, 30 μg/mL de kanamycine ou 25 μg/mL de chloramphénicol, comme requis pour la maintenance du plasmide. Les cultures ont été rafraîchies au 1/100 dans un milieu minimal sélectif M9 (sels de M9 additionnés de 2 mM de MgSO4, 0, 1 mM de CaCl2 et 0, 1% de glucose) pendant 2 h avec 100 μM d'IPTG pour l'induction de la production de recombinase fractionnée OptoCreVvd2. Les cultures ont ensuite été soit exposées à la lumière bleue, soit maintenues dans l'obscurité pendant 2 h. L'exposition à la lumière a été réalisée à l'aide d'un appareil à plaque lumineuse à 24 puits (LPA)72 utilisant des cultures de 1 ml avec deux LED de longueur d'onde de 465 nM par puits (ThorLabs LED465E), avec une puissance totale de 120 μW/cm2 par puits. Pour l'expérience de variation d'intensité lumineuse, le LPA a été utilisé pour délivrer 5, 60 ou 120 μW/cm2 pendant 0,5, 1 ou 2 h en suivant le même protocole.

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été mesurées selon le protocole décrit dans Wiegand et al.73. Les stocks d'antibiotiques ont été constitués en dissolvant l'antibiotique dans de l'eau distillée stérile (carbénicilline, kanamycine, tétracycline) ou de l'éthanol à 99 % (chloramphénicol), avec des concentrations normalisées en fonction des normes CLSI74. Des plaques d'essai pour mesurer la CMI ont été préparées en effectuant des dilutions en série d'antibiotiques dans 100 μL de milieu minimal M9 dans des plaques à 96 puits. Des milieux à faible teneur en glucose ont été utilisés pour réduire la variabilité de la croissance en créant des conditions de croissance limitant le carbone plutôt que les nutriments45. Les concentrations d'antibiotiques ont été sélectionnées pour inclure des valeurs qui couvraient les niveaux de CMI pour les cultures à l'état sombre et clair dans chaque expérience. Immédiatement après l'exposition à la lumière, les cultures ont été normalisées par dilution à la densité optique (DO) la plus faible de chaque expérience. Les cultures normalisées ont ensuite été diluées au 1/25 dans des plaques à 96 puits en triple exemplaire et cultivées pendant une nuit pendant 18 h à 37 °C. La lecture d'absorbance OD de chaque puits a ensuite été mesurée à 600 nm (OD600) à l'aide d'un lecteur de plaque BioTek Synergy H1. Le séquençage post-échantillon pour la souche reporter OptoCre-cat seule a été effectué sur une culture liquide à partir des conditions de croissance de 0 μg/mL et 75 μg/mL (juste en dessous de la CMI), à la fin de la période de croissance de 18 h pour les échantillons présentés dans la Fig. région de terminaison.

Les unités formant colonies (UFC) ont été mesurées en suivant le protocole de micro-spotting décrit dans Sieuwerts et al.75. Après que les plaques MIC ont été cultivées pendant une nuit pendant 18 h, les cultures ont été diluées en série à 1:10 dans des sels 1x M9 dans une plaque à 96 puits. Les dilutions de 10-1 à 10-6 ont été déposées en spot, avec 5 μL sur des plaques de LB-agar en double pour chaque puits (n = 6 pour chaque condition). Les plaques ont été cultivées pendant une nuit à 37 ° C et les colonies ont été comptées à la main le lendemain pour la dilution la plus faible avec des colonies dénombrables pour chaque échantillon. Les nombres d'UFC par mL ont ensuite été calculés en multipliant le niveau de dilution par le nombre moyen de colonies comptées par condition, en normalisant pour le volume de 5 μL plaqué.

Les souches ont été cultivées pendant une nuit à partir d'une seule colonie dans un milieu LB sélectif. Les cultures ont été rafraîchies au 1/100 dans un milieu minimal sélectif M9 pendant 2 h avec 100 μM d'IPTG pour l'induction d'OptoCreVvd2. Les échantillons ont ensuite été placés sur des tampons d'agarose à bas point de fusion à 1, 5% fabriqués avec un milieu minimal M9 contenant 100 μM d'IPTG et 400 μg / ml de kanamycine (activation de knt) ou 60 μg / ml de chloramphénicol (activation de chat). Les échantillons ont été cultivés à 30 ° C pour empêcher les tampons de se dessécher et imagés toutes les 15 min (activation knt) ou 20 min (activation catT172A) pendant 18 h. Pour les expériences d'éclairage à cadre entier, les cellules ont été imagées à 100x à l'aide d'un microscope Nikon Ti-E. L'exposition à la lumière bleue était assurée par un anneau LED (Adafruit NeoPixel 1586), qui était fixé au-dessus de la platine du microscope et contrôlé par un Arduino avec un script Matlab personnalisé pour une puissance totale de 330 μW/cm2. Les images ont été segmentées et analysées à l'aide du logiciel DeLTA 2.076. Les divisions cellulaires ont été annotées à la main. Pour les expériences de dispositif de micromiroir numérique (DMD) éclairant la moitié du champ de vision, les cellules ont été imagées à 100x à l'aide d'un microscope Nikon Ti-2. L'exposition à la lumière a été fournie par un DMD (Mightex Polygon 400) connecté au trajet lumineux d'éclairage du châssis Nikon Ti-2. La lumière du DMD a été passée à travers un filtre de densité neutre à 10 % (Chroma UVND 1.0) pour une puissance totale de 1,2 %, ou 160 mW/cm2, pendant 4 minutes sur 5 pour chaque cycle d'imagerie. Un microcontrôleur Arduino Uno a été utilisé pour synchroniser la caméra, la source d'éclairage et le DMD pour l'acquisition d'images77.

Les souches ont été cultivées pendant une nuit à partir d'une seule colonie dans un milieu LB sélectif. Les cultures ont été rafraîchies 1:50 dans un milieu minimal sélectif M9 contenant 2% de glucose78 et 100 μM d'IPTG pour les souches avec OptoCreVvd2. Les cultures ont été cultivées jusqu'à une DO6oo ≈ 0,2. Les cultures induites contenant OptoCreVvd2 ont ensuite été exposées à la lumière bleue pendant 2 h. Immédiatement après l'exposition à la lumière, 150, 300 ou 600 μg/mL de chloramphénicol ou 1,5, 3 ou 6 μg/mL de tétracycline ont été ajoutés aux cellules induites par OptoCreVvd2. Après 20 h de croissance après induction lumineuse, 400 μL des cultures ont été prélevées et préparées pour la quantification par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). Les souches CpFatB1 exprimées de manière constitutive ont été cultivées dans des conditions identiques mais n'ont pas reçu de lumière ni d'antibiotique. L'extraction et la dérivatisation des acides gras en esters méthyliques d'acides gras ont été réalisées comme décrit par Sarria et al.79. Un étalon interne d'acide nonanoïque (C9) a été ajouté à l'échantillon à une concentration finale de 88,8 mg/L et vortexé avant l'extraction. Les échantillons ont été analysés avec un détecteur Agilent 6890 N/Agilent 5973 MS en utilisant une colonne DB-5MS. La température d'entrée a été fixée à 300 °C avec un débit de 4 mL/min. Le programme de chauffage du four a été initialement réglé à 70 °C pendant 1 min, suivi d'une rampe à 290 °C à 30 °C/min, et d'un maintien final à 290 °C pendant 1 min. L'étalon interne nonanoïque a été utilisé pour la quantification du titre d'acide octanoïque.

Les valeurs OD600 dans les courbes MIC et les diagrammes à barres sont rapportées comme la moyenne de trois échantillons ± l'écart type. Les valeurs de comptage de colonies pour les mesures d'UFC sont rapportées comme la moyenne de six échantillons composés de deux dilutions et de placages pour chaque point de données MIC. La production d'acides gras mesurée à l'aide de GC-MS est rapportée comme la moyenne de trois répétitions biologiques pour chaque condition ± l'écart type. La signification statistique (valeur P) de la production d'acides gras a été évaluée à l'aide d'un test t de Welch à deux queues.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données nécessaires pour évaluer les conclusions sont présentes dans le manuscrit et/ou le matériel supplémentaire. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code d'analyse d'image est basé sur l'algorithme DeLTA 2.0 disponible sur https://gitlab.com/dunloplab/delta.

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Nous remercions Heidi Klumpe pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Nous remercions Caroline Blassick d'avoir créé le mutant catT172A et Mark Isalan de nous avoir indiqué cette variante. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH R01AI102922 et la subvention DOE DE-SC0019387. MBS a reçu un soutien par le biais de la subvention de formation NIH T32 EB006359.

Département de génie biomédical, Université de Boston, Boston, MA, 02215, États-Unis

Michael B. Sheets, Nathan Tague et Mary J. Dunlop

Biological Design Center, Université de Boston, Boston, MA, 02215, États-Unis

Michael B. Sheets, Nathan Tague et Mary J. Dunlop

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MBS et MJD ont conçu et conçu les expériences. MBS a réalisé des expériences d'induction de résistance et analysé les données. MBS et NT ont réalisé des expériences de production d'acides gras et analysé les données. MBS et MJD ont écrit le manuscrit avec la contribution de NT

Correspondance à Mary J. Dunlop.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Feuilles, MB, Tague, N. & Dunlop, MJ Une boîte à outils optogénétique pour la résistance aux antibiotiques inductibles par la lumière. Nat Commun 14, 1034 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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Reçu : 10 juin 2022

Accepté : 13 février 2023

Publié: 23 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36670-2

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