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Nov 29, 2023

Renversement ADAMTSL3

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 5, Article number: 1392 (2022) Citer cet article

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L'insuffisance cardiaque est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde et peut résulter d'une surcharge de pression, où le remodelage cardiaque se caractérise par une hypertrophie et la mort des cardiomyocytes, une fibrose et une inflammation. Dans les cœurs défaillants, le facteur de croissance transformant (TGF) β conduit les fibroblastes cardiaques (CFB) à la différenciation des myofibroblastes, provoquant une production excessive de matrice extracellulaire et un remodelage cardiaque. De nouvelles stratégies pour cibler la signalisation pathologique du TGFβ dans l'insuffisance cardiaque sont nécessaires. Ici, nous montrons que la glycoprotéine sécrétée ADAMTSL3 régule le TGFβ dans le cœur. Nous avons constaté que les souris knock-out Adamtsl3 développent un dysfonctionnement cardiaque et une dilatation exacerbés avec une mortalité accrue, et les cœurs présentent une activité TGFβ accrue et une activation CFB après une surcharge de pression par des bandes aortiques. De plus, la surexpression d'ADAMTSL3 dans les CFB en culture inhibe la signalisation du TGFβ, la différenciation des myofibroblastes et la synthèse du collagène, suggérant un rôle cardioprotecteur pour ADAMTSL3 en régulant l'activité du TGFβ et le phénotype du CFB. Ces résultats justifient une étude future des effets bénéfiques potentiels de l'ADAMTSL3 dans l'insuffisance cardiaque.

L'insuffisance cardiaque est une cause majeure de morbidité, d'hospitalisation et de mortalité dans le monde, affectant 2 à 3 % de la population1. En cas de surcharge de pression, le myocarde se remodèle avec des réponses physiopathologiques caractéristiques, notamment l'hypertrophie et la mort des cardiomyocytes, la fibrose et l'inflammation, la croissance hypertrophique précédant souvent l'insuffisance cardiaque dilatée2.

La matrice extracellulaire (ECM) est cruciale pour le maintien de l'intégrité structurelle et fonctionnelle cardiaque, et les fibroblastes cardiaques (CFB) sont les principaux producteurs d'ECM dans le cœur3. Au cours de l'insuffisance cardiaque, les CFB sont activés et se transdifférencient en myofibroblastes hautement proliférants et producteurs d'ECM3,4, caractérisés par une expression robuste de l'actine musculaire lisse α (α-SMA)5,6. Ce processus est essentiel dans la cicatrisation des plaies, cependant, une activation excessive de la CFB entraîne un remodelage cardiaque pathologique par l'activation du facteur de croissance, l'inflammation, la réduction de la conductance électrique et l'augmentation de la rigidité myocardique, résultant d'un dépôt accru de collagène et d'une réticulation dans la fibrose cardiaque3,7. Le facteur de croissance transformant (TGF)β est nécessaire à l'activation du CFB5 et représente une cible thérapeutique intéressante dans l'insuffisance cardiaque8. Cependant, l'inhibition directe du TGFβ est limitée par des effets hors cible9,10, et une meilleure compréhension de l'activation de la CFB médiée par le TGFβ dans le cœur est nécessaire pour améliorer les résultats de l'insuffisance cardiaque.

Les protéines matricellulaires sont des molécules régulatrices non structurelles exprimées dynamiquement dans l'ECM7 cardiaque. Nous avons récemment identifié qu'une famille à sept membres de protéines matricellulaires, le domaine de type désintégrine et métalloprotéase avec des protéines de type motifs de thrombospondine de type 1 (ADAMTSL), est régulée positivement dans l'insuffisance cardiaque expérimentale et clinique11. Les ADAMTSL sont structurellement liés aux protéases ADAMTS ECM12, mais manquent d'un domaine catalytique, laissant leur fonction biologique largement inconnue. De nombreuses preuves indiquent un rôle dans la régulation du TGFβ, car plusieurs ADAMTSL se lient et régulent les microfibrilles de fibrilline et la protéine de liaison au TGFβ latente (LTBP)1, qui séquestrent le TGFβ dans l'ECM13,14. Des variantes des gènes ADAMTSL phénocopient les fibrillinopathies, avec une signalisation TGFβ dérégulée comme caractéristique moléculaire cohérente11,15,16,17.

Nous rapportons ici la génération et la caractérisation d'une souris avec inactivation ciblée d'Adamtsl3 (L3-KO), que nous avons utilisée pour étudier ADAMTSL3 dans le cœur en surcharge de pression. Nous avons constaté que les souris L3-KO développent un dysfonctionnement et une dilatation cardiaques, avec une mortalité plus élevée, une activité accrue du TGFβ et une activation du CFB après une surcharge de pression induite par les bandes aortiques (AB). La surexpression d'ADAMTSL3 dans des CFB humains en culture a inhibé l'activité du TGFβ et la conversion des myofibroblastes, entraînant une réduction de l'expression de la MEC et de la synthèse du collagène.

L'expression d'ADAMTSL3 a été régulée à la hausse de 2 fois dans les LV de patients atteints de sténose aortique (AS; Fig. 1a), et dans le myocarde de patients atteints de DCM ischémique (iDCM), l'ARNm et la protéine ADAMTSL3 ont été régulés à la hausse de 1,5 fois (Fig. 1b-c). Les caractéristiques des patients ont été précédemment rapportées, avec des patients ayant une SA symptomatique avec hypertrophie VG, fibrose et insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée (HFpEF)18, ou DCM en phase terminale avec fibrose et insuffisance cardiaque dilatée avec fraction d'éjection réduite (HFrEF)19. De même, l'expression d'Adamtsl3 a été multipliée par 2 à 3 dans les LV de souris WT soumises à une procédure AB récemment décrite, pendant une ou six semaines, en utilisant des joints toriques à diamètre fixe20 (Fig. 1d). Les niveaux de protéine ADAMTSL3 n'ont pas été étudiés en raison du manque d'anticorps fonctionnels chez la souris (Fig. S1a-b).

ab Niveaux d'ARNm d'ADAMTSL3/RPL32 dans les biopsies ventriculaires gauches (VG) de patients présentant une sténose aortique (AS, n = 11) et b une cardiomyopathie dilatée ischémique (iDCM, n = 9) par rapport aux témoins respectifs. c Western blot et quantification des taux de protéines ADAMTSL3/protéines totales dans les VG des patients atteints d'iDCM (n = 8) par rapport aux témoins (n ​​= 7). d Niveaux d'ARNm d'Adamtsl3 / Rpl32 dans les LV de souris de type sauvage (WT) 1 et 6 semaines après l'anneau aortique (AB) ou une chirurgie factice (n = 5 factice et n = 7 AB à 1 semaine, n = 8 factice et n = 12 AB à 6 semaines). e Hybridation in situ de l'ARNm d'Adamtsl3 (coloration rouge) dans l'oreillette gauche de souris AB et simulées, et dans la paroi LV de souris AB, 4 semaines après AB, avec contre-coloration nucléaire à l'hématoxyline (violet). f Données de séquençage d'ARN du portail du projet Genotype-Tissue Expression (GTEx). Dans GTEx, un total de 17382 échantillons dans 54 tissus sains, provenant de 948 donneurs d'organes humains décédés, représente une population témoin. Les donneurs sont âgés de 20 à 70 ans, 33 % de femmes, 85 % de race blanche et 13 % d'afro-américains. L'expression d'ADAMTSL3 est présentée sous forme de transcrits par kilobase million (TPM), dans le LV (n = 432, TPM médian = 2,54) et l'appendice auriculaire gauche (LAA, n = 429, TPM médian = 9,66). g niveaux d'ARNm d'Adamtsl3 dans les fibroblastes cardiaques de rat nouveau-né (nrCFB) et les cardiomyocytes (nrCM), avec présence de cellules endothéliales (nrEC), isolées à partir de cœurs de rat âgés de 1 à 3 jours (n = 3 isolements de n = 60 cœurs, avec n = 3 répétitions de culture par isolement). h Niveaux d'ARNm d'Adamtsl3 dans les nrCFB primaires non traités et les nrCFB stimulés avec 5 ng d'IFN-γ. Les données sont des diagrammes de dispersion (a–d, g–h) ou un graphique en violon f avec une moyenne ± SEM. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test t de Student par rapport aux témoins respectifs (a–d, g–h). i Données du EMBL-EBI Single Cell Expression Atlas. Tous les clusters avec 82 types de cellules provenant de 20 tissus de souris (n = 3 femelles et n = 4 souris mâles âgées de 10 à 15 semaines)22, et l'extraction des cellules endothéliales, des cellules du muscle cardiaque, des fibroblastes et des cellules mésenchymateuses (progéniteurs des fibroblastes) sont présentés, et le regroupement de l'expression d'Adamtsl3 (points bleus). La barre d'échelle correspond au nombre de lectures par million (CPM) mappées.

L'hybridation in situ de l'ARN dans les cœurs de souris WT a confirmé l'expression d'Adamtsl3 après AB dans les tissus auriculaire et ventriculaire (Fig. 1e) et a montré l'expression d'Adamtsl3 dans les zones situées entre les cardiomyocytes (CM). De même, ADAMTSL3 a été exprimé dans le VG et l'appendice auriculaire gauche (LAA) (Fig. 1f) de 948 donneurs humains dans la base de données Genotype-Tissue Expression (GTEx)21. Nous avons obtenu des cultures primaires de cœurs de rats nouveau-nés où les CFB ont été séparés des CM, et des cellules endothéliales vasculaires (CE) ont été trouvées dans la fraction CM11. L'analyse qPCR a révélé une expression élevée d'Adamtsl3 dans les CFB par rapport aux CM / CE (Fig. 1g), et son expression dans les CFB était régulée positivement par l'interféron-γ (IFN-γ) (Fig. 1h), suggérant que la signalisation IFN-γ stimule la production d'ADAMTSL3 dans les CFB. Il convient de noter que les valeurs CT pour Adamtsl3 dans la fraction CM / EC étaient relativement élevées (Fig. S2) et, par conséquent, l'expression d'Adamtsl3 était considérée comme très faible dans la fraction CM / EC. Nous avons également exploité la base de données Single Cell Expression Atlas contenant des données d'expression publiées pour 82 types de cellules provenant de 20 tissus de souris22. Conformément aux données de nos cultures cardiaques primaires, des niveaux élevés d'ARNm d'Adamtsl3 ont été observés dans les grappes de fibroblastes et de cellules mésenchymateuses (progéniteurs de fibroblastes) (Fig. 1i). Il y avait une certaine expression dans les CE, alors que l'expression était négligeable dans les CM. Sur cette base, le signal Adamtsl3 dans la fraction nrCM/nrEC provient probablement des CE. Ces ensembles de données indépendants identifient les fibroblastes comme principaux producteurs d'ADAMTSL3 dans les cœurs humains, de souris et de rats.

En utilisant l'édition de gènes médiée par CRISPR-Cas9, un allèle de souris mutant Adamtsl3 a été généré (Fig. 2a). Plus précisément, une délétion de 5 pb dans l'exon 2 (Fig. 2b), codant pour le peptide signal, a entraîné un transcrit hors cadre qui a éliminé l'expression d'Adamtsl3. Les souris homozygotes et hétérozygotes se distinguaient par génotypage Adamtsl3, ARN-seq et qPCR (Fig. S3a-c, respectivement). Les souris adultes L3-KO avaient une apparence extérieurement normale (Fig. S3d) et un poids corporel similaire à celui des témoins WT (tableaux SI-SII). Les souris homozygotes L3-KO ont survécu jusqu'à maturité sans létalité précoce apparente et avaient des dimensions et une fonction cardiaques apparemment normales, mesurées par échocardiographie et IRM cardiaque à l'âge de 8 à 12 semaines (tableau SI). Il convient de noter que les cœurs L3-KO pesaient plus que les cœurs WT (9-13 %) et les cœurs hétérozygotes (13,5 %) de même portée (tableaux SI-SII). Les os du tibia L3-KO étaient plus longs (2 à 3 %) que ceux des compagnons de portée WT, et par conséquent, le poids corporel, qui était similaire dans les trois génotypes, était préféré à la longueur du tibia pour la normalisation du poids des organes au départ (tableaux SI-SII).

a–b Génération de l'allèle mutant Adamtsl3. a Vue d'ensemble du locus Adamtsl3 montrant les exons codants et non codants. L'édition médiée par CRISPR-Cas9 a entraîné une délétion de 5 pb dans l'exon 2. b Séquence autour du site cible de la délétion de 5 pb. Les séquences soulignées indiquent les amorces utilisées pour le génotypage. c Chronologie schématique de l'étude de la souris. Des souris de type sauvage (WT) et Adamtsl3 knock-out (L3-KO) ont subi un anneau aortique (AB) ou une chirurgie factice, et ont été suivies d'une échocardiographie et d'une imagerie par résonance magnétique (IRM) pendant 6 semaines. d Courbes de survie de Kaplan-Meier post-AB. e Changement de poids corporel (PC) par rapport au départ (%), en WT et L3-KO après AB ou chirurgie fictive (n = 8 WT et n = 12 L3-KO). f Poids cardiaque absolu (HW) post-AB. g Masse du ventricule gauche (LVM) post-AB. h Épaisseur du septum interventriculaire en diastole (IVSd), i Épaisseur de la paroi postérieure du VG en diastole (LVPWd), j Diamètre interne du VG en diastole (LVIDd), au départ et après AB par rapport au simulacre. k Volumes télédiastoliques VG (LVEDV) post-AB. l Raccourcissement fractionnaire (FS) au départ et après AB. m Fraction d'éjection VG (FEVG) post-AB. n Diamètre de l'oreillette gauche (LA) à l'inclusion par rapport au simulacre. o Poids pulmonaire absolu (LW) dans les L3-KO et les WT post-AB. p Peptides natriurétiques auriculaires et cérébraux du LV (Nppa, Nppb) et chaînes lourdes de myosine α et β (Myh6, Myh7) 6 semaines après AB ou chirurgie fictive. e–pn = 6 WT et n = 6 L3-KO au départ, n = 12 WT et n = 8-12 L3-KO post-AB, et n = 7-8 WT et n = 9-12 L3-KO post chirurgie fictive. Les données sont moyennes ± SEM. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test du Log-Rank (Mantel-Cox) (d), de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (e, h–j, l, n, p) ou du test t de Student (f–g, k, m, o). Les valeurs de p sont rapportées sous forme de valeurs de p numériques ou *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour AB vs sham, et $p < 0,05, $$p < 0,01 et $$$p < 0,001 pour L3-KO AB vs WT AB.

Les compagnons de litière L3-KO et WT ont été soumis à une postcharge LV accrue par AB en utilisant des joints toriques d'un diamètre intérieur fixe de 0,55 mm, avec une opération fictive effectuée dans les cohortes témoins correspondantes20. Les souris ont été surveillées par échocardiographie et IRM au départ et à une, trois et six semaines après l'opération, et les cœurs ont été prélevés à une et six semaines après AB (Fig. 2c). Les souris L3-KO avaient une mortalité élevée après AB, avec 62% de survie à six semaines, contre 96% de survie des WT et 100% de survie des souris opérées de façon fictive des deux génotypes (Fig. 2d). La majorité des souris L3-KO décédées sont décédées avec un dysfonctionnement cardiaque grave trois semaines après AB. Les deux génotypes avaient un poids corporel similaire au départ et perdaient du poids après l'AB par rapport aux souris opérées de manière fictive, mais les WT ont repris plus de poids que les L3-KO au cours du temps post-AB (Fig. 2e). À six semaines, les L3-KO survivants avaient perdu 10 % de leur poids corporel initial (Fig. 2e) et l'expérience a donc été interrompue. Cette perte de poids corporel était cohérente avec un impact plus délétère dans L3-KO par rapport à WT post-AB.

Étant donné que les souris L3-KO ont perdu plus de poids que les souris WT après AB, le poids des organes après la récolte n'a pas été normalisé au poids corporel. Les cœurs L3-KO récoltés pesaient plus après AB que les cœurs WT (Fig. 2f) et avaient une masse LV absolue supérieure, calculée à partir des dimensions mesurées par IRM (Fig. 2g). L'épaisseur septale interventriculaire (IVSd) (Fig. 2h) et l'épaisseur de la paroi postérieure du VG (LVPWd) (Fig. 2i), mesurées par échocardiographie, étaient similaires au départ et augmentaient dans les deux génotypes une semaine après AB, suggérant un degré similaire de réponse hypertrophique. Cependant, six semaines après l'AB, alors que l'hypertrophie était toujours évidente dans les WT, les parois ventriculaires étaient plus minces dans les L3-KO et ne différaient pas de la ligne de base (Fig. 2h-i). Le diamètre interne du VG (LVIDd) (Fig. 2j) mesuré par échocardiographie et les volumes du VG (LVEDV) (Fig. 2k) mesurés par IRM ont augmenté dans les L3-KO par rapport aux WT tout au long de l'étude d'une à six semaines après AB, indiquant une dilatation cardiaque accrue de L3-KO par rapport aux WT (des images d'échocardiographie représentatives sont présentées sur la Fig. S4a-b). Les L3-KO présentaient un raccourcissement fractionnaire (FS) réduit par rapport aux WT (Fig. 2l) et une FEVG réduite (Fig. 2m) à partir d'une semaine après AB, indiquant une fonction contractile réduite. Le diamètre de l'oreillette gauche (LA) (Fig. 2n) et le poids des poumons (Fig. 2o) ont augmenté dans L3-KO six semaines après AB, suggérant une congestion circulatoire. Enfin, l'expression du peptide natriurétique auriculaire (ANP, Nppa), du peptide natriurétique cérébral (BNP, Nppb) et de la chaîne lourde de la β-myosine (Myh7) a augmenté dans les L3-KO par rapport aux LV WT à six semaines (Fig. 2p), ce qui est cohérent avec le remodelage et le dysfonctionnement des cardiomyocytes en cours23. Dans l'ensemble, ces données démontrent que les L3-KO ont développé une dilatation cardiaque exacerbée et un dysfonctionnement contractile avec une progression plus rapide vers la décompensation par rapport aux WT, sur une postcharge VG également imposée.

Pour comprendre le rôle d'ADAMTSL3 en réponse à la surcharge de pression du VG, nous avons effectué une analyse ARN-seq sur les VG une semaine après l'AB, lorsque les deux génotypes présentaient une hypertrophie cardiaque, mais seuls les cœurs L3-KO étaient dilatés (Fig. 2). Un total de 233 gènes différentiellement exprimés (DEG), 138 régulés positivement et 95 régulés négativement, ont été identifiés dans les L3-KO LV avec un taux de fausse découverte (FDR) <0,05 (Données supplémentaires 1). 21 voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) ont été identifiées à partir des DEG, et les 10 voies les plus enrichies comprenaient les cardiomyopathies, la fonction CM et les interactions cellule-ECM (Fig. 3a). Les analyses d'ontologie génique (GO) ont révélé l'enrichissement de 110 voies biologiques, 50 fonctions moléculaires et 51 catégories de composants cellulaires, et parmi les 10 plus enrichies, plusieurs liées à la contractilité et au remodelage cardiaques, aux interactions cellule-ECM et à la signalisation TGFβ (Fig. 3b – d). Ainsi, une analyse impartiale de l'ARN-seq a révélé l'enrichissement des voies en ligne avec un dysfonctionnement cardiaque exacerbé et un rôle régulateur de l'ECM d'ADAMTSL3. Il est important de noter que les gènes les plus régulés à la hausse dans les cœurs L3-KO comprenaient Nppa et Myh7, conformément au remodelage et au dysfonctionnement des cardiomyocytes23, et le collagène de type I (Col1a1) et la périostine (Postn), dont les niveaux réagissent à la signalisation TGFβ et indiquent une fibrose accrue24 (Fig. 3e – g). L'analyse de la voie d'ingéniosité (IPA, Qiagen) a prédit que le MEF2C et le TGFβ seraient les principaux régulateurs en amont (USR) des DEG liés au CM et au CFB, respectivement (Fig. 3h-i, Données supplémentaires 1).

Une surcharge de pression du ventricule gauche (LV) a été induite chez des souris Adamtsl3 knock-out (L3-KO, n = 10) et de type sauvage (WT, n = 6) par anneau aortique (AB) pendant 1 semaine, et le séquençage de l'ARN a été réalisé sur du tissu LV. 233 gènes exprimés de manière différentielle (DEG, FDR < 0,05) ont été analysés pour l'enrichissement des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et des termes d'ontologie génétique (GO) à l'aide de l'assistant d'analyse v6.8 de la base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée (DAVID)49. Les 10 voies a KEGG les plus enrichies, les voies biologiques b GO, les fonctions moléculaires c GO et les composants cellulaires d GO, identifiées parmi les 233 DEG sont présentées. e Nuage de points comparant les lectures de journaux par million de kilobases (RPKM) de 233 DEG entre L3-KO et WT. Les points rouges correspondent aux DEG annotés dans le graphique. La liste complète des DEG (points gris et rouges) se trouve dans les données supplémentaires 1. fg Modification log2 du RPKM moyen des DEG liés à la structure et à la fonction des cardiomyocytes (CM) (f), et à la matrice extracellulaire (ECM) et à la fibrose cardiaque (g). hi Régulateurs en amont prédits des DEG à partir de l'analyse des voies d'ingéniosité (IPA).

Comme l'analyse bioinformatique des données ARN-seq indiquait une activité accrue du TGFβ dans les cœurs L3-KO une semaine après AB, nous avons mesuré les niveaux de TGFβ actif et de pSMAD2, un médiateur essentiel de la signalisation du TGFβ5, par immunotransfert. Les niveaux de TGFβ actif étaient plus élevés dans les cœurs L3-KO par rapport à WT une et six semaines après AB (Fig. 4a). Après une semaine d'AB, pSMAD2 a été augmenté dans le L3-KO par rapport au simulacre, et après six semaines d'AB, le pSMAD2 était plus élevé dans les cœurs L3-KO par rapport à WT (Fig. 4b), indiquant ainsi une augmentation de la signalisation TGFβ dans les cœurs L3-KO. Dans cette optique, les cœurs L3-KO ont montré une expression accrue du TGFβ (Tgfb1) et de la cible en aval de la signalisation du TGFβ, le facteur de croissance du tissu conjonctif (Ctgf) à six semaines (Fig. 4c). Postn a augmenté de manière comparable dans les deux groupes AB, tandis que Ltbp1 était inchangé dans tous les groupes (Fig. 4c).

a–c Des souris de type sauvage (WT) et Adamtsl3 knock-out (L3-KO) ont été soumises à un anneau aortique (AB) ou à une chirurgie factice pendant un total de 6 semaines. a, b Immunoblots représentatifs et quantifications de TGFβ1 actif/protéine totale (a) et SMAD2 phosphorylé (pSMAD2)/SMAD2 total (b) dans des lysats LV, 1 semaine (fictif : n = 4 WT et n = 4 KO, AB : n = 6-8 WT et n = 12 KO) et 6 semaines (fictif : n = 4 WT et n = 4 KO, AB : n = 12 WT et n = 8 KO) post-AB. c Niveaux d'ARNm/Rpl32 de TGFβ (Tgfb1), facteur de croissance du tissu conjonctif (Ctgf), périostine (Postn) et protéine de liaison latente TGFβ 1 (Ltbp1) chez les souris AB vs simulacre 6 semaines après AB (simulation : n = 8 WT et n = 8 KO, AB : n = 10 WT et n = 7 KO). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey, avec *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour AB vs simulacre, et $p < 0,05, $$p < 0,01 et $$$p < 0,001 pour L3-KO AB vs WT AB. dk Fibroblastes cardiaques fœtaux humains cultivés pendant 7 jours, produisant un réseau de matrice extracellulaire riche (ECM), et transduits avec l'adénovirus ADAMTSL3 (L3) ou témoin (véhicule, Veh) le jour 4. Les données représentent des expériences de 3 passages cellulaires différents. d Immunoblot représentatif et quantification de ADAMTSL3/protéine totale dans les lysats Veh (n = 9) et L3 (n = 11). e 62 gènes régulés négativement et 22 gènes régulés positivement dans des échantillons d'ARNm L3 vs Veh regroupés (n = 18 dans les deux groupes) en utilisant un tableau d'expression de 84 gènes liés au TGFβ, les données sont des valeurs ΔΔCT normalisées à GAPDH. f–g niveaux d'ARNm/RPL4 de la qPCR de TGFB1, LTBP1, CTGF, POSTN (f) et MALAT1 (g) dans L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). h–k Immunoblot représentatif et quantification de pSMAD2/SMAD2 (h), TGFβ1 actif/protéine totale (i), protéine associée à la latence (LAP)/protéine totale, y compris le grand complexe latent (LLC, > 250 kDa) (j) et protéine de liaison TGFβ latente (LTBP1)/GAPDH, y compris la LLC (k), dans L3 (n = 8-9) vs Veh (n = 8) matrice cellulaire et extracellulaire ly assouvit. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test t de Student (d, fk). Toutes les données (sauf e) sont présentées sous forme de diagrammes de dispersion de valeurs individuelles avec moyenne ± SEM.

Pour de plus amples informations mécanistes, nous avons surexprimé l'ADAMTSL3 (L3) pleine longueur et un adénovirus témoin de véhicule (veh) dans des cultures de CFB fœtaux humains (hfCFB) (Fig. S5a), qui forment un vaste réseau ECM11. La surexpression d'ADAMTSL3 a été confirmée par une augmentation de l'ARNm (Fig. S5b) et des protéines (Fig. 4d). En utilisant un réseau d'expression ciblant 84 gènes de la voie de signalisation TGFβ sur des échantillons L3 et Veh regroupés, nous avons trouvé 62 gènes régulés négativement et 22 gènes régulés positivement dans L3 (Fig. 4e). Plusieurs médiateurs centraux de la signalisation canonique du TGFβ, par exemple TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD4, TGFBR1, ont été régulés négativement, et l'inhibiteur de signalisation TGFβ SMAD6 a été régulé positivement. En analysant des échantillons individuels de L3 et de Veh, nous avons constaté que les gènes codant pour les composants du grand complexe latent TGFβ (LLC), c'est-à-dire TGFB1 et LTBP1, les cibles de signalisation TGFβ CTGF et POSTN, ainsi que l'amplificateur de signalisation TGFβ MALAT125, étaient régulés à la baisse dans L3 (Fig. 4f-g). L'immunotransfert a révélé une pSMAD réduite (Fig. 4h) et une réduction du TGFβ actif (Fig. 4i), indiquant une signalisation réduite du TGFβ. De plus, les niveaux de LLC, constitués du peptide associé à la latence (LAP), transcrit à partir du gène TGFB1, et de LTBP1 ont été réduits dans les lysats de cellules L3 et d'ECM (Fig. 4j-k), indiquant une production réduite de TGFβ. Ensemble, les études de perte de fonction et de gain de fonction suggèrent que l'ADAMTSL3 est un inhibiteur de la signalisation TGFβ dans le cœur in vivo et dans les fibroblastes cardiaques in vitro.

Une IRM cardiaque de cartographie de phase tissulaire (TPM) a été réalisée pour évaluer la fonction myocardique. Les deux génotypes ont développé une souche maximale longitudinale et circonférentielle réduite après AB, suggérant un dysfonctionnement systolique (Fig. S6a-b). De plus, les deux génotypes ont développé un taux de déformation diastolique précoce réduit (SRe), ​​indiquant une relaxation moins efficace (Fig. S6c-d), et à trois semaines, L3-KO a montré une SRe circonférentielle LV réduite par rapport à WT (Fig. S6d). L'échocardiographie Doppler a confirmé une altération relative de la fonction cardiaque dans le L3-KO par rapport au WT, car la vitesse d'entrée mitrale maximale (E) (Fig. S6e) et la décélération de l'entrée de la valve mitrale (MVD) (Fig. S6f) étaient réduites dans le L3-KO. Le SRe réduit dans le L3-KO peut refléter la rigidité du VG, qui peut être liée à la fibrose myocardique. Dans une prochaine étape, nous avons donc évalué les effets d'ADAMTSL3 sur l'expression et la biosynthèse du gène ECM.

Dans les données d'ARN-seq, nous avons trouvé Col1a1 régulé à la hausse dans L3-KO vs WT une semaine après AB (Fig. 3g), suggérant une augmentation de la production de collagène à ce moment. Nous avons donc recherché des preuves de fibrose dans des coupes ventriculaires moyennes de souris WT et L3-KO. Une semaine après l'AB, la coloration au trichrome a montré des niveaux de collagène comparables dans les deux génotypes, c'est-à-dire 9 % de collagène dans WT et 11 % de collagène L3-KO contre 0,2-0,3 % dans les témoins fictifs (Fig. 5a et images représentatives de la Fig. S7a). Nous avons également quantifié la teneur en protéines de collagène I par les niveaux d'hydroxyproline dans les LV une semaine après AB, ce qui, conformément à l'histologie, a indiqué une augmentation similaire de la teneur en collagène dans L3-KO et WT après AB vs simulacre (Fig. 5b). Six semaines après AB, les ARNm du collagène I (Col1a1 et Col1a2) et du collagène III (Col3a1) ont augmenté de manière similaire dans les deux génotypes, comme évalué par qPCR (Fig. 5c). De même, la coloration trichrome des sections mi-ventriculaires était comparable dans les deux génotypes, c'est-à-dire 5, 5% de collagène dans WT et 6, 4% de L3-KO à six semaines après AB (Fig. 5d et images représentatives de la Fig. S7b). Ainsi, aucune différence n'a été trouvée dans la quantité de collagène tissulaire entre les génotypes aux deux moments étudiés après AB.

a–f Des souris de type sauvage (WT) et Adamtsl3 knock-out (L3-KO) ont été soumises à un anneau aortique (AB) ou à une chirurgie factice pendant 1 et 6 semaines. a Ventricule gauche (LV) % de collagène total, calculé à partir de sections histologiques mi-ventriculaires colorées au rouge Picrosirius, au vert rapide et au bleu Alcian (RGB) à 1 semaine après AB (Sham : n = 5 WT et n = 5 KO, AB : n = 5 WT et n = 5 KO). b Teneur en collagène de type I du LV, mesurée par HPLC de pic d'hydroxyproline, 1 semaine après AB (Sham : n = 6 WT et n = 5 KO, AB : n = 6 WT et n = 7 KO). c Niveaux d'ARNm LV/Rpl32 des collagènes de type I (Col1a1, Col1a2) et de type III (Col3a1) et de la lysyl oxydase (Lox) (Sham : n = 8 WT et n = 8 KO, AB : n = 10 WT et n = 7 KO). d LV % de collagène total dans les coupes ventriculaires médianes à 6 semaines après AB (Sham : n = 3 WT et n = 3 KO, AB : n = 4 WT et n = 4 KO). e Niveaux de collagène total, de collagène soluble, de collagène insoluble et de réticulation du collagène dans les LV 6 semaines après AB, en utilisant des procédures colorimétriques et enzymatiques sur des coupes ventriculaires moyennes (n = 7 WT et n = 7 KO). ( f ) niveaux d'ARNm / Rpl32 de fibrilline-1/2 (Fbn1, Fbn2), de tropoélastine (Eln1) et de fibronectine-1 (Fn1), dans L3-KO vs WT (Sham : n = 8 WT et n = 8 KO, AB : n = 10 WT et n = 7 KO). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (a–d, f) ou le test t de Student (e). Les valeurs de p sont rapportées comme des valeurs de p exactes ou *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour AB vs sham, et $p < 0,05, $$p < 0,01 et $$$p < 0,001 pour L3-KO AB vs WT AB. g – h, j Des fibroblastes cardiaques fœtaux humains (hfCFB) ont été cultivés pendant 7 jours, produisant un réseau de matrice extracellulaire riche (ECM), et transduits avec l'adénovirus ADAMTSL3 (L3) ou témoin (véhicule, Veh) le jour 4. Les données représentent des expériences dans 3 passages cellulaires différents. g Valeurs d'expression ΔΔCT, normalisées à GAPDH, de 53 gènes régulés négativement et 25 gènes régulés positivement dans des échantillons d'ARNm L3 vs Veh regroupés (n = 18 dans les deux groupes) à l'aide d'un tableau d'expression de 78 gènes d'adhésion cellulaire et liés à l'ECM. h Niveaux d'ARNm/RPL4 de qPCR de COL1A1, COL1A2, COL3A1, LOX dans L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). i Synthèse des protéines de collagène, mesurée par désintégration radioactive (coups par minute) de la [3H]-proline, incorporée pendant 48 h dans les CFB L3 et Veh, isolée à partir de rats âgés de 1 à 3 jours (n = 3 isolements avec n = 60 cœurs donnant n = 3 à 4 répétitions techniques par isolement). j Niveaux d'ARNm/RPL4 de la qPCR de FBN1, FBN2, ELN et FN1 dans L3 (n = 16) vs Veh (n = 18) hfCFB. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test t de Student (hj). Toutes les données (sauf g) sont présentées sous forme de diagrammes de dispersion de valeurs individuelles avec une moyenne ± SEM.

L'ARNm de la lysyl oxydase (Lox) a été multiplié par 1, 7 dans L3-KO par rapport à WT six semaines après AB (Fig. 5c), ce qui pourrait indiquer une augmentation de la réticulation du collagène dans la L3-KO. Nous avons donc analysé la teneur en collagène total, soluble et insoluble à six semaines post-AB en utilisant des dosages colorimétriques et enzymatiques sur des coupes médio-ventriculaires. Fait important, les LV L3-KO avaient des niveaux plus élevés de collagène insoluble par rapport au WT (Fig. 5e). La différence de réticulation calculée du collagène (rapport entre le collagène insoluble et le collagène soluble) n'a cependant pas atteint la signification (p = 0, 139) entre les génotypes (Fig. 5e).

Pour examiner si ADAMTSL3 régule l'expression de l'ECM in vitro, nous avons utilisé un tableau d'expression ciblant 78 gènes d'ECM et d'adhésion cellulaire, et avons trouvé 53 gènes régulés négativement et 25 gènes régulés positivement dans des échantillons regroupés de L3 contre Veh. Plusieurs gènes d'adhésion cellulaire ont été régulés positivement, par exemple SELL, SELP, PECAM1 et VCAM1. Conformément à l'augmentation de l'expression dans les cœurs L3-KO AB, COL1A1, ITGB1 et CTGF ont été régulés à la baisse dans L3, tout comme plusieurs métalloprotéinases sécrétées et matricielles de surface cellulaire (MMP) et les protéases ADAMTS (Fig. 5g). L'expression réduite de COL1A1 a été confirmée dans des échantillons individuels de hfCFB, alors que COL3A1 était inchangé (Fig. 5h). La production de protéines de collagène a été étudiée plus en détail dans les nrCFB L3 vs Veh avec une ECM en développement (Fig. S5c-d), en utilisant l'incorporation de proline radiomarquée. Fait important, nous avons constaté que les cultures L3 incorporaient 25% moins de radio-proline que Veh (Fig. 5i), ce qui suggère qu'ADAMTSL3 inhibe les niveaux de protéines de collagène des fibroblastes cardiaques. Conformément à l'expression accrue de Lox dans les cœurs L3-KO (Fig. 5c), la surexpression de L3 dans le hfCFB a réduit l'ARNm de LOX (Fig. 5h), ce qui suggère que l'ADAMTSL peut inhiber la réticulation du collagène. Dans les cœurs L3-KO six semaines après AB, l'expression de l'élastine (Eln) était 1, 8 fois supérieure à celle de Veh, tandis que l'expression des fibrillines (Fbn1 / 2) et de la fibronectine (Fn1) était inchangée (Fig. 5f). Enfin, l'expression des microfibrilles a été analysée dans des cultures de hfCFB produisant un vaste réseau de microfibrilles11 et a montré une expression réduite de FBN1, FBN2, ELN et FN1 dans L3 par rapport à Veh (Fig. 5j). Notamment, les fibrilles de fibronectine soutiennent l'assemblage du collagène I, des microfibrilles de fibrilline, de l'élastine et de la LTBP-1 dans l'ECM26. Ensemble, nos données démontrent qu'ADAMTSL3 affecte la synthèse et la réticulation du collagène, ainsi que la synthèse d'autres molécules ECM structurelles dans les cultures hfCFB, et en réponse à une surcharge de pression.

L'ostéopontine (SPP1) est essentielle à la différenciation des myofibroblastes et a été identifiée comme la molécule la plus régulée négativement dans le tableau d'expression de L3 contre Veh (Fig. 5g). Nous avons donc examiné la différenciation des myofibroblastes dans les cœurs WT et L3-KO. Nous avons trouvé des niveaux d'expression comparables du marqueur de signature des myofibroblastes α-SMA (Acta2) entre les groupes une semaine et six semaines après AB (Fig. 6a), mais l'immunotransfert pour la protéine α-SMA a révélé une augmentation de 2, 5 fois de L3-KO par rapport à WT une semaine après AB (Fig. 6b), indiquant une différenciation accrue des myofibroblastes. L'expression de SPP1 a été augmentée dans les deux génotypes après AB, avec des niveaux plus élevés dans les cœurs L3-KO par rapport à WT (Fig. 6c), ce qui a été confirmé au niveau des protéines (Fig. 6d). L'expression d'ACTA2 a été réduite de 40% dans les cultures L3 hfCFB par rapport à Veh (Fig. 6e), et la protéine α-SMA a été réduite de 25% (Fig. 6f). Nous avons confirmé la régulation négative de SPP1 dans des échantillons individuels de hfCFB L3 à 10% des niveaux de Veh (Fig. 6g) et une réduction de 40% de la protéine ostéopontine par rapport à Veh (Fig. 6h), indiquant une différenciation réduite des myofibroblastes. Ensuite, les caractéristiques pro-fibrotiques des CFB activés, c'est-à-dire la prolifération et la capacité acquise à contracter ECM6, ont été étudiées, révélant une expression réduite des marqueurs cellulaires prolifératifs: antigène nucléaire cellulaire prolifératif (PCNA), Ki-67 (KI67) et le composant 2 du complexe de maintenance du mini-chromosome (MCM2) dans L3 (Fig. 6i), ainsi qu'une incorporation réduite d'EdU (Fig. 6j). Plus important encore, les cellules surexprimant ADAMTSL3 ont montré une capacité réduite à contracter les gels de collagène (Fig. 6k), fournissant une lecture fonctionnelle de la différenciation altérée des myofibroblastes.

a–d Des souris de type sauvage (WT) et Adamtsl3 knock-out (L3-KO) ont été soumises à un anneau aortique (AB) ou à une chirurgie factice pendant 1 et 6 semaines. a Niveaux d'ARNm/Rpl32 d'actine musculaire lisse α (α-SMA, Acta2). b Immunoblots représentatifs et quantification de l'α-SMA dans des extraits de protéines LV de WT et L3-KO 1 et 6 semaines après AB ou chirurgie fictive. c Niveaux d'ARNm/Rpl32 d'ostéopontine (OPN, Spp1). d Immunoblots représentatifs et quantification de l'OPN dans des extraits de protéines LV de WT et L3-KO 1 et 6 semaines après AB ou chirurgie fictive. À 1 semaine après AB, n = 4-5 WT et n = 4 KO fictif, et n = 6–7 WT et n = 8–9 KO AB. À 6 semaines après AB, n = 4-8 WT et n = 4-8 KO fictif, et n = 10-12 WT et n = 7-8 KO AB. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey (ad). Les valeurs P sont rapportées comme *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour AB vs simulacre, et $p < 0,05, $$p < 0,01 et $$$p < 0,001 pour L3-KO AB vs WT AB. e–k Des fibroblastes cardiaques fœtaux humains (hfCFB) ont été cultivés pendant 7 jours, produisant un réseau de matrice extracellulaire riche (ECM), et transduits avec l'adénovirus ADAMTSL3 (L3) ou témoin (véhicule, Veh) le jour 4. Des expériences ont été réalisées à 3 passages cellulaires différents. e Niveaux ACTA2/RPL4 en L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). f Immunoblot représentatif et quantification de α-SMA/GAPDH dans L3 (n = 8) vs Veh (n = 8). g Niveaux SPP1/RPL4 en L3 (n = 16) vs Veh (n = 18). f Immunoblot représentatif et quantification de l'OPN/protéine totale dans L3 (n = 8) vs Veh (n = 8). i niveaux d'ARNm/RPL4 de l'antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA), marqueur de prolifération Ki-67 (KI67) et composant 2 du complexe de maintenance du mini-chromosome (MCM2) dans L3 (n = 18) vs Veh (n = 18). j Unités de fluorescence relative (RFU) reflétant l'incorporation d'EdU, comme mesure de la prolifération, dans L3 vs Veh (n = 48). Les données sont données avec la moyenne ± SEM (a–j). k Contraction du gel de collagène des hfCFB, en % de contraction de la zone de gel initiale, à 2, 4 et 6 h, en L3 (n = 12) vs Veh (n = 24). L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test t de Student (p – k), avec des valeurs de p rapportées sous forme de valeurs numériques (e – j) ou ** p <0, 01 et *** p <0, 001, et les mesures répétées bidirectionnelles ANOVA avec la correction de Geisser-Greenhouse pour la comparaison de plusieurs points de temps (k, valeur p exacte indiquée dans le graphique).

Conformément à la contractilité réduite dans les cœurs L3-KO post-AB, l'ARN-seq a révélé des gènes de sarcomère et de contractilité CM dérégulés, par exemple le récepteur de la ryanodine (Ryr2), la titine (Ttn), l'échangeur sodium-calcium (NCX, Slc8a1), SERCA (Atp2a2) et phospholamban (Pln) (Fig. 3e – g). Ainsi, nous avons étudié les CM isolés de souris adultes WT et L3-KO. Les CM étaient de taille similaire entre les génotypes (Fig. S8a), avec une longueur de sarcomère au repos comparable (Fig. S8b). Au cours de la stimulation électrique à 1 Hz, les CM présentaient des amplitudes de contraction similaires, avec un raccourcissement cellulaire parallèle par provocation à l'isoprotérénol (Fig. S8c) et une cinétique de contraction (Fig. S8d) et de relaxation (Fig. S8e) similaire, suggérant un développement normal des CM dans les cœurs L3-KO. Comme le phénotype des CM isolés était similaire dans WT et L3-KO, et que l'expression d'Adamtsl3 n'était pas détectée dans les CM (Fig. 1i), le dysfonctionnement contractile exacerbé observé dans L3-KO post-AB a été interprété comme secondaire à une altération de la fonction ECM et CFB.

Dans la présente étude, nous avons étudié la régulation d'ADAMTSL3 dans les biopsies de patients souffrant d'insuffisance cardiaque et son rôle dans le remodelage cardiaque après une surcharge de pression LV induite par AB chez des souris L3-KO et WT. ADAMTSL3 a été régulé positivement dans les cœurs défaillants des patients et des souris après AB, et a été principalement produit par les CFB. Fait important, les souris L3-KO ont démontré une dysfonction contractile exacerbée et une dilatation du VG, avec une mortalité plus élevée après une surcharge de pression du VG. Les analyses moléculaires des cœurs L3-KO et WT post-AB ont révélé une augmentation de la signalisation TGFβ, une activation CFB et une production dérégulée d'ECM, avec des niveaux accrus de collagène insoluble dans L3-KO. La surexpression d'ADAMTSL3 dans les CFB en culture a inhibé la signalisation du TGFβ, la conversion des myofibroblastes, l'expression de l'ECM et la synthèse du collagène. Collectivement, nos données suggèrent un rôle cardioprotecteur pour ADAMTSL3 dans le cœur défaillant, par l'inhibition de l'activité du TGFβ et de la différenciation des myofibroblastes, avec des conséquences pour l'ECM cardiaque, le remodelage cardiaque et la fonction sur des stimuli pathogènes.

Les niveaux d'ADAMTSL3 ont augmenté dans les biopsies cardiaques de patients souffrant d'insuffisance cardiaque et nos études chez la souris démontrent un rôle important d'ADAMTSL3 pour la fonction cardiaque et la survie. Après une surcharge de pression du LV, le L3-KO a développé un dysfonctionnement contractile exacerbé et une dilatation cardiaque. L'ARN-seq des cœurs post-AB a révélé des DEG associés à la cardiomyopathie, à la manipulation du calcium CM et à la contractilité dans le L3-KO. Étant donné que nous n'avons pas détecté l'expression d'Adamtsl3 dans les CM et qu'aucune différence n'a été observée dans la fonction CM entre les CM L3-KO et WT isolés, nous interprétons la fonction cardiaque réduite dans les L3-KO comme secondaire à une régulation altérée de la MEC par les CFB.

Au départ, les souris L3-KO étaient viables et avaient un poids corporel normal sans phénotype apparent, à l'exception des membres légèrement plus longs. Bien que la fonction ou les dimensions cardiaques de base, telles que mesurées par échocardiographie et IRM, n'aient pas été affectées par l'inactivation d'Adamtsl3, les cœurs de souris L3-KO non stressées avaient augmenté de poids. Cela indique que l'interprétation du phénotype cardiaque post-AB doit être faite avec prudence, car les cœurs L3-KO peuvent être prédisposés à une maladie exacerbée en réponse à un facteur de stress.

Importantly, our study directly links ADAMTSL3 to cardiac function. This link was previously suggested, as ADAMTSL3 is part of a rare syndrome known as Tetrasomy 15q25, arising from an inverted duplication of the distal chromosome 15qter identified with SNP microarray in a patient with multiple anomalies including complex cardiovascular malformation. Am. J. Med. Genet. A 158a, 1971–1976 (2012)." href="/articles/s42003-022-04361-1#ref-CR27" id="ref-link-section-d79610379e2679"> 27,28. Les caractéristiques des patients comprennent des anomalies de croissance et des malformations cardiaques complexes associées à une mortalité élevée28. Les malformations cardiaques phénotypiques n'apparaissent que lorsque ADAMTSL3 fait partie de la duplication chromosomique28. Des malformations cardiaques sont également rapportées chez des patients présentant une microdélétion chromosomique hétérozygote de la même région, y compris ADAMTSL329,30.

La relation fonctionnelle entre les membres de la famille ADAMTSL et les microfibrilles de fibrilline13,15,17 suggère que les ADAMTSL sont des régulateurs du TGFβ, une fonction précédemment démontrée pour ADAMTSL211,31 et ADAMTSL614. Notre étude s'ajoute au nombre croissant de preuves impliquant les protéines ADAMTSL dans la régulation du TGFβ, car nous montrons ici une augmentation des niveaux et de l'activité du TGFβ dans les cœurs L3-KO post-AB, et l'inhibition du TGFβ dans les CFB en culture surexprimant ADAMTSL3. Comme le TGFβ est un régulateur majeur de l'activation du CFB et de la production d'ECM pro-fibrotique dans le cœur défaillant7,32, cela peut suggérer que l'ADAMTSL3 est un régulateur négatif de la signalisation fibrotique et pathogène dans le cœur. ADAMTSL3 a régulé l'activation des CFB dans les cœurs de souris ainsi que dans les CFB humains en culture, illustrée par des niveaux altérés des marqueurs myofibroblastes α-SMA et ostéopontine, ainsi que par une altération de la contraction des CFB en réponse à la surexpression d'ADAMTSL3. Dans les CFB humains en culture, la surexpression d'ADAMTSL3 a entraîné une expression altérée des molécules d'ECM, y compris le collagène. Bien que nous n'ayons pas observé de changements dans le collagène total dans les cœurs in vivo, l'inactivation d'Adamtsl3 a entraîné une altération de la qualité de l'ECM dans le myocarde, avec une augmentation des niveaux de collagène insoluble, qui, selon nous, pourrait être attribuée à une expression accrue de Lox. Des preuves récentes suggèrent que le cœur défaillant contient des populations distinctes de CFB activés, qui présentent des caractéristiques variables, telles que hautement contractiles ou hautement productrices de collagène4,33. Nous supposons que ADAMTSL3 peut affecter la différenciation de populations spécifiques de myofibroblastes qui remodèlent le myocarde autrement que par la simple production de collagène. En effet, plus de 30 gènes ECM dérégulés ont été identifiés dans les myofibroblastes activés de cœurs blessés34. Après la surexpression d'ADAMTSL3 dans les CFB, nous avons trouvé une expression réduite de FBN1, FBN2, FN1 et ELN, suggérant une régulation des protéines ECM qui séquestrent le complexe TGFβ latent. L'expression d'Eln a été augmentée en conséquence dans les cœurs L3-KO.

Le TGFβ a longtemps été attrayant en tant que cible thérapeutique potentielle dans les maladies cardiaques, cependant, la traduction clinique est limitée par des effets indésirables32 et des stratégies alternatives pour l'inhibition de la voie du TGFβ sont justifiées35. De plus, la différenciation des myofibroblastes s'est avérée réversible dans le cœur défaillant35 et peut être une cible thérapeutique importante. Reste à savoir si ADAMTSL3 détient un potentiel thérapeutique pour l'inhibition de la différenciation des myofibroblastes. Mécaniquement, ADAMTSL3 se lie à la fibrilline-1 et au LTBP113, indiquant un mécanisme potentiel de régulation de l'activité du TGFβ. Nous suggérons que ADAMTSL3 limite la biodisponibilité du TGFβ dans l'ECM, éventuellement en conjonction avec ADAMTSL211. Nous proposons en outre l'IFN-γ, un régulateur négatif du TGFβ et de la signalisation pro-fibrotique dans le cœur36,37, comme régulateur en amont de l'ADAMTSL3.

En conclusion, la mortalité accrue et le phénotype cardiaque exacerbé des souris L3-KO après une surcharge de pression suggèrent un rôle cardioprotecteur pour ADAMTSL3 dans le cœur défaillant. Mécaniquement, nos résultats indiquent que ADAMTSL3 soutient la fonction cardiaque en limitant l'activation du TGFβ et la différenciation des myofibroblastes. Dans des recherches futures, cette possibilité pourrait être abordée en augmentant expérimentalement les niveaux d'ADAMTSL3 dans des modèles de maladies cardiaques, afin de révéler des effets cardioprotecteurs potentiels.

L'utilisation de biopsies cardiaques humaines a été approuvée par le Comité régional d'éthique de la recherche médicale (REK ID 07482a et 2010/2226) de la South-Eastern Regional Health Authority, Norvège, et est conforme à la Déclaration d'Helsinki. Tous les patients, ou les proches parents des donneurs témoins, ont signé un consentement éclairé écrit. Les biopsies ont été obtenues à l'hôpital universitaire d'Oslo (OUH) et tous les patients ont reçu une évaluation clinique, un traitement et un suivi standard conformément aux directives de l'hôpital. Les modèles de souris et les expériences ont été approuvés par la Cleveland Clinic IACUC (numéro de protocole 2020-2450) et le Comité national norvégien de recherche sur les animaux (ID d'approbation 16614) et étaient conformes au Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, ainsi qu'aux directives ARRIVE pour les rapports de recherche sur les animaux.

Chez les patients atteints de SA symptomatique, des biopsies de la paroi libre du VG (n = 11) ont été réalisées lors d'une chirurgie à cœur ouvert pour un remplacement valvulaire aortique. Des biopsies témoins du VG (n = 11) ont été prélevées sur des tissus se contractant normalement de patients subissant une intervention chirurgicale pour maladie coronarienne. Les caractéristiques des patients ont été décrites précédemment18. En bref, tous les patients avaient une FE > 50 %. Les patients SA avaient un VG non dilaté (LVIDd 4,81 ± 0,23 cm) et des parois VG hypertrophiques (IVSd 1,26 ± 0,06 cm et LVPWd 1,22 ± 0,07 cm). En raison du nombre limité d'échantillons, seul l'ARN a été isolé de cette cohorte.

Des biopsies LV de patients atteints de DCM ischémique secondaire (n = 20) ont été obtenues à partir de cœurs battant immédiatement après l'explantation. Le tissu VG de cœurs non malades envisagés pour une transplantation, mais rejetés pour des raisons chirurgicales, a servi de contrôle (n = 3 échantillons d'ARN et n = 7 échantillons de protéines). Les caractéristiques des patients et des donneurs ont été décrites précédemment19. En bref, les cœurs étaient dilatés (LVIDd 7,41 ± 0,22 cm), avaient une fonction systolique réduite (FEVG de 19,2 ± 1,6 %) et les parois n'étaient pas hypertrophiques (IVSd 0,81 ± 0,05 cm et LVPWd 0,71 ± 0,02 cm, respectivement). Les échantillons de tissus ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à -70 ° C.

Un nouvel allèle mutant Adamtsl3 a été généré chez des souris C56BL/6 J à l'aide de CRISPR/Cas9. Un ARN guide (ARNg) avec la séquence 5' CAGCCACCAGGATCCTGTCC 3' (séquence protospacer adjacent motif (PAM) soulignée) a été sélectionné pour cibler l'exon 2 (le peptide signal) du gène Adamtsl3 (ENSMUST00000173828.2). L'ARNg a été transcrit in vitro par Applied StemCell Inc (Milpitas, CA, USA) pour générer des molécules d'ARNg uniques. Le séquençage Sanger de la région ciblée amplifiée par PCR a indiqué une activité de 62,5 %. En conséquence, cet ARNg avec la protéine Cas9 a été injecté dans des embryons C57BL/6 J qui ont été transférés sur des mères porteuses CD1 et analysés par amplification PCR ultérieure de la région ciblée à l'aide d'ADN génomique et d'analyse de séquence. Une souris fondatrice avec une délétion de 5 pb validée par la séquence Sanger, avec transmission germinale de l'allèle mutant, a été conservée et croisée avec la souche C57BL/6 J. Les biopsies d'oreille WT et L3-KO ont été génotypées à l'aide de l'amorce directe WT : 5'-GGCTTCCTGGACAGGATCC-3', ou de l'amorce directe L3-KO : 5'-CCCATGGCTTCCTGGATCC-3', et d'une amorce inverse commune : 5'-GGGTGTGTTAACAGTGAATCC-3', dans deux réactions de PCR distinctes, avec des produits de PCR résultants de 428 pb (Fig. S3a). L'expression supprimée d'Adamtsl3 dans les cœurs L3-KO a été confirmée par RNA-seq (Fig. S3b) et RT-qPCR (Fig. S3c) du tissu LV.

Une surcharge de pression cardiaque due à une augmentation de la postcharge du VG a été induite chez des compagnons de portée mâles L3-KO et WT âgés de 8 à 11 semaines par un chirurgien souris expérimenté, aveugle au génotype. Le cerclage de haute précision de l'aorte ascendante (AB) a été réalisé à l'aide d'une procédure améliorée, comme décrit récemment, avec des joints toriques en nitrile d'un diamètre intérieur fixe (0,55 mm)20 plutôt qu'une suture, ce qui a entraîné une restriction reproductible du flux sanguin, une faible mortalité postopératoire et des phénotypes cardiaques cohérents. Les souris ont été anesthésiées en respirant de l'oxygène avec 4 % d'isoflurane dans une chambre et intubées et ventilées en respirant 2 % d'isoflurane pendant une chirurgie AB ou fictive. Des injections sous-cutanées de 0,3 mg/mL de buprénorphine (0,1 mg/kg) ont été administrées avant et après la chirurgie. Des analgésiques supplémentaires ont été administrés aux animaux présentant des signes de douleur au cours des 24 heures suivantes.

L'échocardiographie a été réalisée au départ, et une, trois et six semaines après AB. Les animaux ont été anesthésiés dans une chambre avec 4 % d'isoflurane et l'anesthésie a été maintenue en respirant 1 à 2 % d'isoflurane à travers un masque. Les dimensions cardiaques ont été capturées par un opérateur aveugle et expérimenté à l'aide du système d'imagerie VEVO 2100 (VisualSonics, Toronto, Canada). L'analyse des images d'échocardiographie a été réalisée en aveugle au génotype à l'aide du logiciel d'analyse par ultrasons Vevo LAB (VisualSonics).

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) a été réalisée au départ, et une et trois semaines après AB. Les animaux ont été anesthésiés dans une chambre avec 4% d'isoflurane, et l'anesthésie a été maintenue sur 1-2% d'isoflurane. Les acquisitions ont été prospectivement contrôlées par la respiration et déclenchées par le pic R. L'électrocardiogramme (ECG), la fréquence respiratoire et la température corporelle ont été surveillés pendant l'examen. L'acquisition IRM a été réalisée à l'aide d'un aimant 9,4 T (Bruker, USA) avec une bobine radiofréquence Rapid QUAD de 35 mm. Une tranche de séquence CINE grand axe à 4 chambres ainsi qu'une pile de tranches petit axe couvrant le VG ont été acquises. Les paramètres d'imagerie étaient : temps d'échocardiographie = 1,7 ms (grand axe) et 2,05 ms (petit axe), temps de répétition = 5,0 ms (grand axe) et 4,7 ms (petit axe), champ de vision = 25 mm × 25 mm, matrice = 128 pixels x 128 pixels, épaisseur de coupe = 1,0 mm, angle de bascule 15°, moyenne du signal = 3 fois, durée totale d'acquisition = 1-2 min (grand axe) et 6- 10 min (petit axe). Nous avons acquis un enregistrement de cartographie de phase tissulaire (TPM) à axe long à 4 chambres et un enregistrement de cartographie de phase tissulaire à axe court (TPM) à l'aide d'une détection compressée38. Les paramètres TPM étaient : temps d'échocardiographie = 1,7 ms, temps de répétition = 3,5 ms, champ de vision = 25 mm × 25 mm, matrice = 96 × 24 pixels (sous-échantillonnage 4x, 96 × 96 après reconstruction), épaisseur de coupe = 1 mm, angle de bascule = 10°, pour un temps d'acquisition total d'environ 1,5 à 3 min par coupe, en fonction de la fréquence cardiaque. L'analyse a été effectuée en aveugle à l'aide de scripts MATLAB internes, comme décrit précédemment39.

Les animaux ont été anesthésiés dans une chambre avec 5 % d'isoflurane, et des cœurs et des poumons battant ont été prélevés sur des animaux sous anesthésie terminale profonde respirant 5 % d'isoflurane à travers un masque. Les LV ont été excisés, rincés dans du PBS, congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à -70 ° C.

Les cœurs de souris opérées AB ou fictives ont été fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et inclus dans de la paraffine. Des sections de paraffine de 7 μm ont été coupées et l'ARNm d'Adamtsl3 a été détecté par hybridation in situ avec la technologie RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Cat. No. 465521). Un four HybEZ a été utilisé pour l'hybridation et le kit de détection 2.5 HD Red a été utilisé pour la visualisation. Le tissu a été contre-coloré avec de l'hématoxyline. Un microscope Olympus BX51 (Olympus, Center Valley, PA) avec une caméra Leica DFC7000T a été utilisé pour l'imagerie avec le logiciel Leica Application Suite v4.6.

Le tissu LV congelé par pression a été fixé dans du PFA à 4% et inclus dans de la paraffine. Des coupes médio-ventriculaires de 7 µm d'épaisseur ont été réalisées sur des lames de verre Superfrost Plus (Fisher) à l'aide d'un microtome Leica RM2255. Ces lames ont ensuite été colorées avec une coloration trichrome Picrosirius Red, Fast Green et Alcian Blue (RGB) comme décrit avec précision40, pour visualiser la protéine de collagène dans les coupes. Les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope droit Olympus BX51 avec une caméra Leica DFC7000T et le logiciel d'imagerie Leica Application Suite v4.6. Les zones contenant du collagène, basées sur des seuils de couleur, ont été détectées automatiquement à partir d'images trichromes RVB par une macro personnalisée Fiji ImageJ 1.53c (NIH, USA), qui calculait le pourcentage de fibrose. La même macro a été appliquée à toutes les images des deux génotypes aux deux moments.

L'analyse quantitative de l'hydroxyproline dans les LV de souris, une mesure de la teneur en protéines de collagène, a été réalisée en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec le kit AccQ-Fluor (Cat # WAT052880, Waters, MA, USA) selon le protocole du fabricant. 15 mg de tissu ont été homogénéisés dans de l'azote liquide, hydrolysés pendant une nuit dans HCl 6 M à 112 ° C, séchés et dérivatisés avec le tampon borate AccQ-Fluor (Waters). Les dérivés ont été séparés par HPLC en phase inverse avec le système Ultimate 3000 (Nerliens Meszansky, Oslo, Norvège) et quantifiés par détection de fluorescence, avec des étalons d'hydroxyproline (Fluka, Buchs SG, Suisse).

Le collagène insoluble dans les coupes ventriculaires moyennes a été mesuré à l'aide d'un test colorimétrique vert rapide/rouge picrosirius, en soustrayant le collagène soluble du collagène total. Le collagène total a été mesuré comme décrit précédemment41, et un dosage enzymatique à base de Sircol (Biocolor, Royaume-Uni) a été utilisé pour quantifier le collagène soluble42. La réticulation du collagène a été calculée comme le rapport du collagène insoluble et soluble. Toutes les mesures ont été effectuées en double par un chercheur expérimenté, ignorant le génotype. La quantité de collagène a été normalisée par rapport aux protéines totales.

Les cardiomyocytes LV ont été isolés à partir de souris WT et L3-KO comme décrit précédemment43. En bref, des cœurs fraîchement excisés ont été canulés à travers l'aorte sur une configuration de Langendorff à débit constant, perfusés avec un tampon d'isolement contenant (en mmol/L) : 130 NaCl, 5,4 KCl, 25 HEPES, 0,5 MgCl2, 0,4 NaH2PO4 et 22 glucose, pH 7,40, 37 °C. Après lavage, les cœurs ont été digérés par perfusion avec une solution de collagénase de type 2 à 2,0 mg/mL (290 unités/mg, Worthington Biomedical Corp., Lakewood, NJ, USA) pendant 6 min. Le LV a été disséqué et agité avec 0,2 mg de DNase (Worthington) et 250 µL de BSA (40 mg/mL). Les cellules ont été filtrées à travers une maille de 200 µm et décantées. Le culot a été lavé deux fois et les niveaux de Ca2+ ont été progressivement augmentés jusqu'à 0,2 mM. Les CM isolés ont été étalés dans une chambre sur un microscope inversé (Observer D1, Zeiss, Allemagne) et continuellement surfusés avec du tampon Hepes Tyrode (37 ° C) contenant (en mmol / L) : 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 MgCl2, 5,0 Hepes, 5,5 glucose, 0,4 NaH2PO4, pH 7,40. Pendant les enregistrements, les cellules ont été stimulées à 1 Hz. Les positions des sarcomères ont été enregistrées à l'aide d'un objectif à eau 63 x/1,2 W (Objective C-Apochromat, Zeiss, Allemagne) et d'une caméra haute vitesse (caméra numérique CMOS C11440-22CU, Hamamatsu, Japon) à une cadence de 2 ms. Les contractions individuelles des sarcomères ont été analysées par Image J (NIH), Clampfit (Axon Instruments) et des scripts Python personnalisés. En bref, les images en fond clair ont été inversées et filtrées par un filtre passe-bande FFT (Fast Fourier Transform). Une région contenant 10-15 sarcomères a été sélectionnée. L'intensité de chaque ligne de pixel verticale a été moyennée et les positions de la ligne Z (valeur de crête) ont été obtenues par une courbe d'ajustement utilisant des fonctions paraboliques. En soustrayant les positions voisines de la ligne Z, des contractions de sarcomère unique ont été obtenues et normalisées au SL au repos pour obtenir un raccourcissement fractionnaire. Les données ont été moyennées sur 10 à 15 sarcomères dans chaque cellule et sur 3 contractions consécutives.

Les CM primaires de rat néonatal (nrCM) et les CFB (nrCFB) ont été isolés comme décrit précédemment44. En bref, des cœurs battants ont été récoltés sur des rats Wistar âgés de 1 à 3 jours (Janvier Labs) après décapitation. Les ventricules ont été excisés et digérés avec une solution de pancréatine/collagénase. La population de cellules adhérentes a été isolée des cellules non adhérentes par attachement de 20 min à des flacons de culture non revêtus. Selon la microscopie et les analyses qPCR11, ces cellules étaient principalement des CFB. Les CFB ont été cultivés pendant une semaine, puis étalés à 3,8 × 104 cellules/cm2 dans des plaques à six puits, et cultivés pendant une autre semaine avant la récolte. La fraction cellulaire non attachée, principalement des CM, mais avec la présence d'ECs11, a été étalée à 3,8 × 104 cellules/cm2 sur des plaques à six puits recouvertes de gélatine et de fibronectine. Toutes les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (Gibco) contenant du sérum, dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C. ADAMTSL3 a été surexprimé dans les CFB de rats nouveau-nés à l'aide d'un vecteur d'adénovirus humain déficient en réplication de sérotype 5 (Ad5 dE1/E3) codant pour ADAMTSL3 (Genbank RefSeq BC128389) sous le promoteur du cytomégalovirus (CMV) (L3), ou d'un véhicule témoin (Ad5 dE1/E3-CMV-Null) (Veh) (tous deux disponibles dans le commerce auprès de Vector Biolabs, PA, États-Unis). Les cellules ont été ensemencées et transduites après 24 h (jour 1) dans un protocole de culture de 4 jours (Fig. S5a), dans lequel les cellules déposent un réseau ECM immature en développement11. La transduction a été réalisée dans un milieu de croissance à un titre viral de 5 × 106 unités formant plaque (PFU), donnant une multiplicité d'infection (MOI) de 100. Le milieu de croissance a été remplacé par un milieu sans sérum 24 h après la transduction. La surexpression réussie a été vérifiée par une augmentation de l'ARNm d'Adamtsl3 dans les cellules témoins L3 vs Veh (Fig. S5b). Pour la stimulation avec l'IFN-γ, les cellules ont été cultivées dans un milieu sans sérum pendant 24 h, et 5 ng/mL d'IFN-γ recombinant (Z03274, GenScript, NJ, USA) ont été ajoutés 3 h avant la récolte.

Des fibroblastes cardiaques fœtaux humains (hfCFB) ont été obtenus auprès de Cell Applications, Inc (Cat# 306-05 f) et cultivés dans un milieu de croissance de fibroblastes cardiaques (Cat# 316-500, Cell Applications) ou un milieu de base de fibroblastes (Cat# 115-500, Cell Applications), tous deux additionnés de 1 % de pénicilline/streptomycine, dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C. Les cellules ont été étalées à 10 000 cellules/cm2 pour les expériences, sauf indication contraire. Un protocole de culture hfCFB unique a été utilisé, dans lequel les cellules développent une ECM mature, comprenant des composants du système TGFβ, comme décrit précédemment11. En bref, les cellules ont été cultivées pendant sept jours au total et transduites le jour 4 avec L3 ou Veh à 5 x 106 PFU. Après 24 h, le milieu de transduction a été remplacé par un milieu de base sans sérum (Fig. S5c). La surexpression réussie a été vérifiée par une augmentation de l'ARNm d'ADAMTSL3 dans les cellules témoins L3 vs Veh (Fig. S5d).

Le test de contraction du gel de collagène a été réalisé essentiellement comme décrit11. Les hfCFB transduits par L3 ou Veh ont été trypsinisés, centrifugés et remis en suspension dans un milieu sans sérum. Les cellules ont été mélangées avec une solution de collagène contenant 3 mg/mL de collagène bovin I (Bovine PureCol®, Advanced BioMatrix), 2x DMEM (Merck Millipore) et 0,2 M HEPES (pH 8), et étalées à 36,5 × 103 cellules/cm2 dans des plaques à 24 puits, pré-enduites de 2 % de BSA dans du PBS pendant une nuit à 37 °C. Les gels de collagène ont polymérisé pendant 2 h à 37 ° C et un milieu sans sérum a été ajouté pour détacher les gels. La circonférence des gels, correspondant à la quantité de contraction du gel, a été mesurée 6 et 24 h plus tard, en utilisant ImageJ 1.53c (NIH).

Les nrCFB ont été ensemencés dans des plaques à 12 puits et transduits avec Veh ou L3 après 24 h. Le milieu a été remplacé après 24 h par un milieu sans sérum contenant 50 µM/mL d'acide ascorbique et 1 µCi de L-[2,3-3H]-Proline (Cat# NET323001 MC, PerkinElmer, Inc, MA). Au jour 4, les cellules ont été lavées avec du PBS froid, lysées dans du NaOH 1 M et diluées à l'aide du cocktail de scintillation liquide OptiPhase HiSafe 3 (Cat # 1200.437, PerkinElmer). La quantité de proline radiomarquée présente dans chaque échantillon, en tant que substitut de la biosynthèse des protéines de collagène45, a été mesurée en coups par minute (CPM) à l'aide du compteur à scintillation liquide Wallac Winspectral 1414 (PerkinElmer).

Des hfCFB transduits par L3 ou Veh ont été étalés à 1000 cellules / mm2 dans des plaques à 96 puits (Cat # 6005430, Perkin Elmer). Les cellules ont été marquées avec 10 µM d'EdU pendant 2 h, après 24 h de privation de sérum. Les cellules ont été fixées à l'aide du test de prolifération Click-iT™ EdU (Cat# C10499, CyQUANT, Invitrogen) et la fluorescence EdU a été mesurée sur le lecteur de microplaques Hidex Sense (LabLogic Systems, Sheffield, Royaume-Uni), essentiellement comme décrit11.

L'ARN total a été isolé à partir de tissus cardiaques ou de cellules cultivées avec le kit RNeasy Mini (Cat # 74106, Qiagen Nordic, Norvège). Le kit de synthèse d'ADNc iScript (Cat # 1708891, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) a été utilisé pour la transcription inverse et la génération d'ADNc à partir d'ARN isolé. L'expression génique relative dans chaque échantillon a été déterminée à l'aide des tests d'expression génique TaqMan (tableau SIII) et des matrices d'expression génique TaqMan préfabriquées pour la voie TGFB (Cat # 4414097) et la matrice extracellulaire humaine et les molécules d'adhésion (Cat # 4414133), avec TaqMan Universal PCR Master Mix (Cat # 4304437). Le système de PCR en temps réel QuantStudio 3 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a été utilisé pour l'amplification et la détection par PCR.

Le séquençage de l'ARN (ARN-seq) a été effectué sur du tissu LV isolé à partir de cœurs WT (n = 6) et L3-KO (n = 10) une semaine après AB, de la même manière que décrit précédemment46. En bref, l'ARN total a été isolé à l'aide du réactif TRI (Sigma Aldrich) par extraction au phénol-chloroforme. Le tissu LV a été homogénéisé dans 1 ml de réactif TRI à l'aide du Tissuelyzer II (Qiagen). L'ARN ribosomal a été éliminé à l'aide du kit de déplétion d'ARNr NEBNext® (humain/souris/rat, New England Biolabs). Les bibliothèques d'ARN-seq totaux ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèques CORALL Total RNA-Seq (Lexogen), avec des billes AMPure (Beckman Coulter) pour la purification. Qualité des bibliothèques RNA-seq contrôlée à l'aide du bioanalyseur 2100 (Agilent). Le contrôle qualité et le séquençage ont été effectués dans les installations de séquençage de nouvelle génération du Babraham Institute, à Cambridge, au Royaume-Uni. Les bibliothèques d'ARN-seq ont été séquencées sur une voie du HiSeq2500 (Illumina) avec la séquence de séquençage HiSeq2500-RapidRun 100 bp Single End. Les données d'ARN-seq ont été alignées à l'aide de HiSAT247 sur le génome de référence de Mus musculus GRCm38/mm10. Les lectures ont été coupées avant l'alignement à l'aide de Trim Galore, avec un score de qualité Phred pour le seuil d'appel de base de 20, correspondant à une erreur maximale de 1 sur 100 bases, et avec un taux d'erreur de coupe maximal de 0,1. Les fichiers de séquence coupés et alignés ont été importés en tant que fichiers BAM dans SeqMonk (v1.42.0) pour la visualisation et l'analyse. Les lectures d'ARN-seq ont été quantifiées par quantification du nombre de lectures et normalisation globale effectuée sur le nombre total de lectures pour chaque bibliothèque et exprimées en lectures par kilobase million (RPKM). L'analyse des gènes différentiellement exprimés (DEG) a été réalisée à l'aide du logiciel basé sur R DESeq248. Le nombre de lectures brutes (sans transformation logarithmique) a été utilisé comme entrée et la normalisation globale a été effectuée sur la taille totale de la bibliothèque.

Les données d'expression cellulaire Adamtsl3 de souris ont été obtenues à partir de la base de données Single Cell Expression Atlas (https://www.ebi.ac.uk/gxa/sc/home), EMBL-EBI, Cambridgeshire, Royaume-Uni, consultée le 31.05.2022)22. Les données d'expression de l'ADAMTSL3 humain provenant du LAA et du LV de donneurs d'organes décédés ont été obtenues à partir du portail du projet GTEx (https://gtexportal.org/home), Broad Institute, Boston, MA, consulté le 31.05.2021). Les graphiques ont été modifiés à partir des fonctions graphiques interactives des bases de données.

Les protéines ont été extraites de tissus cardiaques humains et de souris selon un protocole précédemment décrit20,44, avec un tampon de lyse à base de PBS contenant du Triton X‐100 (1 %), du Tween‐20 (0,1 %), des inhibiteurs de protéase (cOmplete EDTA‐free Mini, Roche Diagnostics) et des inhibiteurs de phosphatase PhosStop (Roche Diagnostics). Les protéines des cultures cellulaires ont été extraites à l'aide d'un tampon de lyse contenant du SDS (1 %) et du Tris-HCl (31,5 mM, pH 6,8). Les lysats de protéines ont été soniqués à l'aide du Branson Sonifier® S-150D (Emerson Electric Co. St. Louis, MO), centrifugés à 15 000 G pendant 20 min, et le surnageant a été stocké à -70 °C. La SDS-PAGE et l'immunoempreinte ont été réalisées à l'aide de gels Criterion TGX et de membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) sur le système de transfert semi-sec Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Les anticorps suivants ont été utilisés : anti-phospho-Smad2 (Ser465/467, Cat # 3108, Cell Signaling), anti-Smad2/3 (Cat # 3102, 8685, Cell Signaling), tous deux dilués au 1:1000 dans du lait à 5%, anti-TGFb (Ab92486, Abcam) 1:1000, 1% de caséine, anti-LAP (AF-246, R& D Systems) 1:1000 dans du lait 5% dans des conditions non réductrices, anti-LTBP1 (Cat # MAB-388, R&D Systems) dilué 1:1000 dans du lait 5% dans des conditions non réductrices, anti-α-SMA (Cat # A5228, Sigma) dilué 1:10 000 dans du lait 5%, anti-OPN (Ab181440, Abcam) 1:1000 dans Lait à 1 %, anti-GAPDH (Cat # sc-32233, Santa Cruz Biotechnology) dilué à 1:1000 dans du lait à 5 %, anti-ADAMTSL3 (HPA034773, Atlas Antibodies) à 1:1000 dans de la caséine à 1 % et anti-ADAMTSL3 (anticorps polyclonal maison produit chez le lapin) à 1:1000 dans de la caséine à 1 %. Des anticorps secondaires de souris ou de lapin (1:2000, Santa Cruz Biotechnology) ont été utilisés. Le réactif de détection ECL Prime Western Blotting (Amersham) a été utilisé pour la détection secondaire des anticorps et la protéine totale a été détectée à l'aide de la coloration des protéines Revert 700 (Licor). La fluorescence ou la chimiluminescence a été imagée à l'aide du système d'imagerie Western Blot Azure 600 (Azure Biosciences). Les bandes de protéines ont été quantifiées à l'aide d'ImageJ 1.53c (NIH). Les membranes Western blot complètes utilisées pour les calculs sont présentées sous Transferts supplémentaires dans les informations supplémentaires.

Les différences statistiques ont été testées à l'aide de Prism 8.3.0 (GraphPad). Les données sont présentées avec la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). La distribution des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Lors de la comparaison de deux groupes distribués normalement, le test t de Student non apparié a été appliqué. Lors de la comparaison de plusieurs groupes, une ANOVA unidirectionnelle avec les tests de comparaisons multiples de Tukey ou Dunnett a été appliquée. Pour la comparaison de plusieurs points dans le temps, l'ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles avec la correction de Geisser-Greenhouse a été utilisée. Pour comparer les courbes de survie, le test du Log-Rank (Mantel-Cox) a été réalisé. Les valeurs de P <0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les valeurs P sont rapportées sous forme de valeurs exactes ou, pour les données du modèle de souris, la signification est donnée sous forme de symboles représentant *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour AB vs simulacre, et $p < 0,05, $$p < 0,01 et $$$p < 0,001 pour L3-KO AB vs WT AB. Pour les données RNA-seq, les valeurs RPKM ≥ 1,0 ont été jugées supérieures au bruit et les gènes avec ≥ 1,0 dans quatre échantillons ou plus ont été jugés détectables dans cet ensemble de données. La correction de Benjamini-Hochberg pour les tests multiples a été utilisée et le FDR de 0,05. L'analyse d'enrichissement fonctionnel pour les termes GO et les voies KEGG a été effectuée dans l'assistant d'analyse v6.8 de la base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée (DAVID) v6.8 (accessible le 27.08.21), et l'IPA de Qiagen a été utilisée pour la prédiction des régulateurs en amont. Toutes les expériences de culture cellulaire ont été menées au moins trois fois, représentant trois répétitions biologiques, c'est-à-dire des cycles d'isolement pour les cellules primaires ou des points de temps d'ensemencement séparés pour les CFB fœtaux humains, chaque expérience avec deux répétitions techniques ou plus. Les expériences de souris in vivo ont été menées dans trois cohortes distinctes. Deux cohortes ont été récoltées à une semaine et une cohorte a été récoltée à six semaines. Le n de chaque expérience est donné dans les légendes des figures respectives, avec n = 3–12 dans chaque groupe pour chaque analyse.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données RNA-seq utilisées pour générer les tracés et les graphiques de la Fig. 3 sont téléchargées dans les données supplémentaires 1 et ont été déposées dans leur intégralité dans les archives européennes de nucléotides (ENA, EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, Royaume-Uni), accession : PRJEB47017. Toutes les données sources numériques utilisées pour générer les figures principales sont téléchargées Données supplémentaires 2. Les images Western blot non éditées utilisées pour générer les figures sont présentées sous Blots supplémentaires dans les informations supplémentaires. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil de la recherche de Norvège ; le Fonds Anders Jahre pour la promotion de la science ; la régie régionale de la santé du sud-est; la Fondation Kristian Gerhard Jebsen ; subventions de recherche stratégique interne de l'hôpital universitaire d'Akershus ; la Fondation Blix pour la Promotion de la Recherche Médicale ; et le Olav Raagholt et Gerd Meidel Raagholt's Fund for Science, Norvège à [IGL] ; le Allen Distinguished Investigator Program, grâce au soutien apporté par le Paul G. Allen Frontiers Group, la Marfan Foundation et l'American Heart Association à [SSA] ; un prix du programme des jeunes talents de la Dutch Heart Foundation de l'Initiative néerlandaise de recherche cardiovasculaire (CVON), consortiums RECONNECT [ELR] ; la Dutch Cardiovascular Alliance, CVON She-PREDICTS, subvention 2017-21, Double Dosis, 2020-B005, FWO G091018N et FWO G0B5930N à [SH] ; et l'Institut de Santé Carlos III (ISCIII) (PI18/01469, PI21/00946 et CB16/11/00483), projets cofinancés par le Fonds européen de développement régional à [AG]. Nous sommes reconnaissants à Almira Hasic et Dina Behmen de l'Institut de recherche médicale expérimentale et au personnel de l'animalerie KPM Ullevål de l'hôpital universitaire d'Oslo pour leur excellente assistance technique.

Institut de recherche médicale expérimentale, Hôpital universitaire d'Oslo et Université d'Oslo, Oslo, Norvège

Karoline B. Rypdal, A. Olav Melleby, Jia Li, Sheryl Palmero, Kristine Andreassen, Ivar Sjaastad, Theis Tønnessen, Mathis K. Stokke, William E. Louch, Geir Christensen et Ida G. Lunde

Division des diagnostics et de la technologie, Hôpital universitaire d'Akershus, Lørenskog, Norvège

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Begoña Lopez & Arantxa González

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Begoña Lopez & Arantxa González

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Christen P. Dahl

Département de chirurgie cardiothoracique, Hôpital universitaire d'Oslo Ullevål, Oslo, Norvège

Theis Tønessen

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Stéphane Heymans

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Conceptualisation et conception de l'étude : KBR, AOM, SSA, GC, IGL Acquisition des données : KBR, AOM, ELR, BL, CC, JL, DES, DM, SP, KA, CPD, IS, TT, IGL accepter d'être responsable de tous les aspects du travail.

Correspondance à Karoline B. Rypdal.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Éditeur principal de la manipulation : Eve Rogers.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Rypdal, KB, Olav Melleby, A., Robinson, EL et al. Les souris knock-out ADAMTSL3 développent un dysfonctionnement cardiaque et une dilatation avec une signalisation TGFβ accrue après une surcharge de pression. Commun Biol 5, 1392 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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Reçu : 01 janvier 2022

Accepté : 09 décembre 2022

Publié: 20 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04361-1

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